Caracterização molecular e funcional de peptídeos de anuros e seus análogos : efeitos sobre patógenos microbianos e células tumorais

Abstract

A resistência antimicrobiana representa um dos maiores desafios da medicina moderna e implica que esforços devem ser empenhados na pesquisa e desenvolvimento de novas drogas sob o risco de retornarmos à era pré-antibiótica. Dentre as alternativas, os peptídeos antimicrobianos representam uma fonte interessante de moléculas que atuam principalmente na membrana plasmática das bactérias, um sítio de ação que é notadamente menos propenso ao desenvolvimento de resistência. Até o momento, mais de três mil peptídeos antimicrobianos já foram descritos, sendo a secreção cutânea de anfíbios a principal fonte dessas moléculas com quase um terço dos peptídeos descritos. Além da atividade antimicrobiana, muitos destes peptídeos também apresentam atividade sobre células tumorais. Na primeira parte desta tese, investigamos os efeitos de dois peptídeos isolados da secreção cutânea do anuro Boana raniceps sobre bactérias, fungos e formas epimastigotas de Trypanosoma cruzi, além seus efeitos sobre células eucarióticas e eritrócitos. Na segunda parte, desenvolvemos dez análogos tendo como base o peptídeo citotóxico pentadactilina, isolada inicialmente da rã Leptodactylus labyrinthicus, com o objetivo de potencializar os efeitos biológicos desejados e, ao mesmo tempo, reduzir os efeitos deletérios. De maneira geral, observamos que alterações estruturais nos análogos foram associadas com uma atividade biológica mais potente. Por outro lado, observamos que algumas alterações nos peptídeos favoreceu substancialmente a atividade sobre a bactéria Gram-positiva Staphylococcus aureus, enquanto que para a bactéria Gram-negativa Escherichia coli houve diminuição na atividade. Por outro lado, outras mudanças estruturais culminou na perda total de atividade sobre bactérias e também sobre as células eucarióticas testadas. Para avaliarmos os efeitos dos análogos sobre células eucarióticas usamos técnicas de citometria de fluxo e proteômica. Usando a citometria de fluxo, observamos que os análogos 6 e 8 (AN6 e AN8), induziram várias alterações nas linhagens de células B16F10 e MCF-7, tais como mudanças no tamanho e granulosidade e marcação positiva para anexina V/FITC e iodeto de propídio, sugerindo a ocorrência de necrose. Também observamos que houve uma marcação expressiva para caspases quando testamos as células B16F10 tratadas com os peptídeos. O tratamento de células B16F10 e MCF-7 com os peptídeos AN6 e AN8 induziu a despolarização da membrana mitocondrial, já a permeabilidade lisossômica não foi afetada nas células B16F10, enquanto que houve uma permeabilidade lisossômica nas células MCF-7 tratadas com ambos os peptídeos com significância estatística. Observou-se também uma significante fragmentação de DNA nas duas linhagens tratadas tanto com o AN6 quanto ao AN8. Por outro lado, as alterações no ciclo celular foram observadas majoritariamente nas células B16F10. Na análise proteômica, usamos a linhagem B16F10 tratada com o peptídeo AN6. Após análise estatística, encontramos 242 proteínas diferencialmente expressas das quais 103 estavam com o padrão de abundância aumentada e 139 proteínas com abundância diminuída em relação ao controle. Diferentemente do que observamos nos ensaios de citometria, não encontramos proteínas relacionadas com processos de morte celular com a expressão aumentada.