Diversidade patogênica e molecular de ralstonia solanacearum da região Amazônica

Abstract

A diversidade de Ralstonia solanacearum no Estado do Amazonas foi estudada em 70 isolados obtidos de plantas de tomate e outras hospedeiras com sintomas de murcha. Inicialmente, os isolados foram renovados pelo reisolamento após inoculação na hospedeira, identificados em biovares e classificados de acordo com o grau de virulência em plantas de tomate cv. IPA-5, pimentão cv. Cascadura Ikeda e chicória da Amazônia (Eryngium foetidum) inoculadas em casa de vegetação mergulhando suas raízes em suspensão bacteriana (108ufc/ml). Mudas inoculadas foram transplantadas para vasos de 1L contendo solo esterilizado. As avaliações foram feitas através de escala de notas de 1 a 5 aos quatro, oito e 12 dias após a inoculação em plantas de tomate, seis, oito e 12 dias após a inoculação em pimentão e aos oito, 11 e 14 dias após a inoculação em chicória da Amazônia. Um índice de murcha bacteriana (IMB) foi calculado pela fórmula IMB= £(C x P) / N, onde C = nota atribuída a cada classe de sintoma; P = número de plântulas em cada classe de sintoma e N = número total de plantas inoculadas. De 70 isolados, 53 pertencem à biovar I, quatro isolados à biovar N2 e 13 isolados à biovar III. O agrupamento em plantas de tomate pela distância euclidiana mostrou três classes distintas de virulência onde, 61,4% dos isolados foram “altamente virulentos”, 24,3% foram “mediamente virulentos” e 14,3% foram “fracamente virulentos”. O agrupamento de virulência em pimentão mostrou 17 % de isolados “altamente virulentos”, 11% de isolados “medianamente virulentos” e 72% de isolados “fracamente virulentos”. A diferenciação de grupos comprova a diferença de suscetibilidade de tomate e pimentão em relação às biovares I e III. Quando inoculados em chicória da Amazônia, somente os isolados de chicória provocaram murcha nesta hospedeira, indicando uma especificidade pouco comum para este patógeno. Com o objetivo de caracterizar a diversidade genética de Ralstonia solanacearum na Região Amazônica, 46 isolados de tomate e 18 de outras 10 espécies hospedeiras, coletados nos ecossistemas de terrafirme (52 isolados) e de várzea (12 isolados) e em diferentes localidades dos Estados do Amazonas, l Pará e Acre, durante o período de dezembro de 1997 a dezembro de 2000, foram comparados através de BOX-PCR. A amplificação com o primer BOXA1R gerou 28 amplicons, variando entre 360 a 2.072 pb. A análise visual dos perfis eletroforéticos revelou alto grau de polimorfismo entre os isolados, observado principalmente entre a região de 600 a 1.500 pb. Os relacionamentos genéticos entre os isolados foram determinados pelo coeficiente de similaridade de Jaccard e análise de agrupamento (UPGMA). Ao nível de 23% de similaridade, cinco grupos foram identificados, sem correlação aparente com hospedeira de origem, biovar, ecossistema ou local de coleta. No entanto, o isolado de chicória da Amazônia (Eryngium foetidum) foi o mais divergente, com apenas 4% de similaridade em relação aos demais. Os isolados de tomate foram separados em três grupos. Uma maior diversidade de perfis genômicos foi identificada entre os isolados da biovar I, que foram distribuídos em quatro grupos, enquanto que todos os quatro isolados de tomate da biovar N2 formaram um único agrupamento, separado dos isolados das demais biovares presentes na Região Amazônica (I e III). A análise de seqüências do gene rRNA de 16S tem fornecido informações importantes em relação a filogenia e processos evolucionários de Ralstonia solanacearum bem como de diversos microorganismos. No entanto, nenhum estudo extensivo de caracterização foi conduzido utilizando esta ferramenta molecular com isolados brasileiros de R. solanacearum, incluindo aqueles endêmicos da Região Amazônica. Neste trabalho uma seqüência parcial do gene rRNA de 16S foi utilizada para a caracterização de 23 isolados obtidos de diferentes hospedeiras na Região Amazônica. A amplificação via PCR usando “primers” universais para o gene rRNA de 16S gerou um único amplicon (260 pb) em todos os isolados. Uma alíquota deste produto de PCR foi diretamente sequenciada e o resultado da análise comparativa entre as seqüências obtidas para estes isolados e as disponíveis no GenBank permitiu distinguir as diferentes espécies dentro do gênero Ralstonia. Todos isolados da Região Amazônica apresentam apresentaram identidade de seqüência bastante estreitas entre si (98,0 - 100,0%), formando um agrupamento relacionado com a espécie R. solanacearum. Consistentes diferenças foram observadas nos isolados estudados na posição correspondente ao nucleotídeo 51 do consenso (onde um C foi preferencialmente substituído por 2 um T), sendo o mesmo padrão observado em alguns isolados de R. pickettii e Burkholderia spp. O isolado R. solanacearum ‘CNPH 189’ (biovar I) obtido de chicória (Eryngium foetidum / família Apiaceae), apresentou a mais acentuada divergência entre os isolados da Amazônia. Estes resultados associados com estudos prévios de diversidade genética usando o sistema de marcadores BOX-PCR bem como estudos de especificidade hospedeira, onde ‘CNPH 189’ foi único isolado capaz de induzir sintomas de murcha em plantas de chicória, sugerem que este isolado possa representar um novo taxum dentro do complexo R. solanacearum. A identificação de um isolado potencialmente pertencente a um possível novo grupamento taxonômico na amostra de isolados estudada indica que uma investigação mais extensiva da variabilidade genética deveria ser conduzida visando caracterizar os agentes causais de murcha bacteriana em diferentes hospedeiras na Amazônia bem como em outras regiões brasileiras. O trabalho reportado aqui representa o primeiro esforço conduzido no Brasil para caracterizar a diversidade genética de isolados de R. solanacearum via análise comparativa da seqüência de segmentos do genoma deste fitopatógeno.