Análise da seqüência das glicoproteínas de tospovírus com ocorrência no brasil e estudo da reação de resistência de Capsicum chinense a tomato spotted wilt virus

Abstract

A espécie-tipo do gênero Tospovirus, o Tomato spotted wilt virus (TSWV), causa uma séria doença em centenas de espécies de plantas, sendo disseminada pelo mundo através do inseto vetor tripés. No Brasil, os tospovirus TSWV, Tomato chlorotic spot virus (TCSV) e Groundnut ringspot virus (GRSV) são responsáveis por elevados danos econômicos em importantes culturas, incluindo alface, amendoim, fumo, pimenta, pimentão e tomate. O genoma dos tospovirus é constituído por três segmentos de RNA fita simples (denominadosS, M e L RNA), codificando três proteínas estruturais (L, G1 e G2) e duas proteínas não-estruturais (NSm e NSs). As glicoproteínas G1 e G2 são projetadas a partir do envelope lipídico e possivelmente apresentam função importante durante a entrada do vírus nas células do vetor e, consequentemente, na transmissão viral. Esta tese descreve a análise do precursor das glicoproteínas e das regiões intergênica e 3’ terminal do M RNA do TCSV e do GRSV, baseando-se na determinação e comparação das seqüências dos aminoácidos e nucleotídeos dessas duas espécies com as de outros tospovirus. Os resultados das comparações indicaram que a seqüência de aminoácidos dos precursores das glicoproteínas do TCSV apresentou 81% de identidade com o TSWV, enquanto o GRSV apresentou 79% com o TSWV. Ao serem comparadas as seqüências de aminoácidos dos precursores do TCSV e GRSV entre si, a identidade aumentou para 92%, indicando que essas duas espécies mostraram alta similaridade e diferiram das demais espécies de tospovirus. Entretanto, o resultado da comparação das seqüências de nucleotídeos da região intergênica do M RNA do TCSV e GRSV mostrou ser de apenas 78% de identidade. As análises filogenéticas, baseadas nas seqüências do precursor das glicoproteínas e da região intergênica do M RNA, revelaram que TCSV e GRSV formaram um só agrupamento, próximo ao TSWV e distante das demais espécies de tospovirus. Os parâmetros taxonômicos relacionados à delimitação das espécies de tospovirus foram ainda discutidos. Na última década, foi relatada a reação de resistência tipo hipersensibilidade (HR) em acessos de Capsicum chinense ‘P1152225’ e ‘P1159236’ inoculados mecanicamente com TSWV. A segunda parte da tese descreve a identificação do provável gene de avirulência elicitor da reação de HR em C. chinense ‘P1159236’, conforme a teoria gene-a-gene de Flor (1942). Com este intuito, os genes das proteínas N (nucleoproteína), NSm (proteína de movimento) e NSs foram clonados individualmente no vetor binário pgR107 (pPVX), baseado no sistema de expressão Potato virus X (PVX). Os clones de Agrobacterium tumefaciens recombinantes transformados com as construções PVX+N, PVX+NSm, PVX+NSs, assim como o controle (A. Tumefaciens transformada com pPVX), foram inoculadas com palito em C. chinense ‘P1159236’, Datura stramonium e Nicotiana benthamiana. Os sintomas de PVX (clareamento de nervura, clorose internerval e mosqueado) apareceram na maioria das plantas inoculadas com as construções PVX+N, PVX+NSm e PVX+NSs. ELISA e “western blotting” foram realizados com as plantas sintomáticas e confirmaram a expressão das proteínas N, NSm e NSs. As plantas de C. chinense ‘P1159236’, Datura stramonium e Nicotiana benthamiana inoculadas com a contrução PVX+NSs mostraram expressão de sintomas necróticos sistêmicos severos, provavelmente causados pelo sinergismo do PVX com a proteína NSs-. As plantas inoculadas com a construção PVX+NSm mostraram sintomas idênticos à infecção ocasionada por pPVX, sugerindo que a proteína NSM não interferiu na expressão dos sintomas do PVX. Lesões cloróticas e necróticas tipo - HR acompanhadas por abscisão foliar foram observadas somente em C. chinense ‘P1159236’ inoculadas com a construção PVX+N, diferindo significativamente dos sintomas causados pelo pPVX e PVX selvagem. Esses resultados indicaram que o gene N provavelmente é o gene de avirulência elicitor da reação tipo - HR em C. chinense PI159236.