Caracterização fenotípica, bioquímica e molecular de bactérias dos gêneros Bacillus, Lysinibacillus, Priestia e Brevibacillus com potencial atividade entomocida, fungicida e solubilizadora de fosfato

Abstract

A identificação correta de microrganismos destinados a produtos biológicos é de suma importância, uma vez que garante a qualidade do produto produzido. Assim, o uso de técnicas clássicas, como características morfológicas e bioquímicas, ou por métodos sofisticados, como sequenciamento genético NGS e/ou qPCR que auxiliam nesse processo. Desse modo, o objetivo geral desse trabalho foi identificar e caracterizar por métodos fenotípicos clássicos e genéticos, 37 estirpes candidatas a referência pertencentes aos gêneros Bacillus, Lysinibacillus, Priestia e Brevibacillus, com potencial atividade entomicida, fungicida e solubilizadora de fósforo. Para a execução do trabalho, todas as estirpes foram retiradas da Coleção de Bactéria de Invertebrados da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia. Assim, inicialmente foram sequenciadas 21 estirpes, os quais foram identificadas como Bacillus thuringiensis, B. cereus, B. mycoides, B. tropicus, B. paranthracis, B. subtilis, B. amyloliquefaciens, B. licheniformis, B. pumilus, B. spizizenii, Priestia megaterium, P. aryabhattai, Lysinibacillus capsici e Brevibacillus laterosporus, também foram detectados nos genomas das cepas, genes codificadores de metabólitos secundários. Foram desenvolvidos primers específicos para a identificação de 29 espécies pertencentes aos gêneros Bacillus, Lysinibacillus, Priestia, Brevibacillus e Paenibacillus, em que 20 obtiveram bons resultados. Posteriormente os mesmos foram usados na identificação de 600 estirpes, como forma de validação do método. Desse modo, foram identificadas 458 estirpes, em que 80% foram de espécies pertencentes ao grupo B. cereus. A caracterização morfológica das 37 estirpes foi realizada seguindo os princípios de Bergy’s Manual of Systematic Bacteriology. Por esse método, verificou-se que as cepas apresentaram características morfológicas e citomorfológicas heterogênicas. Na caracterização bioquímica por perfis de resistência à antimicrobianos, foram adotados os métodos de discodifusão e diluição em ágar com diferentes tipos de antibióticos e concentrações. O teste de resistência a antimicrobianos indicou que 95% dos isolados foram resistentes a pelo menos um ou mais dos 23 antibióticos testados. Todas as cepas pertencentes ao grupo B. cereus s.l foram resistentes a antibióticos da classe dos β-lactâmicos. Também foi realizado a identificação das 37 cepas por espectrometria de massa – MALDI TOF, no entanto, apenas uma cepa foi 100% identificada em nível de gênero e espécie, B. mycoides, quando utilizado o banco de dados disponível no software MALDI-Biotyper®. O confronto de perfis com o banco de dados suplementar, alimentado pelos espectros das 37 estirpes, resultou na identificação de apenas 9 cepas. Foi avaliado o potencial entomicida das 37 cepas à insetos das ordens Lepidoptera (Spodoptera frugiperda, Helicoverpa armigera, Chrysodeixis includens), Coleoptera (Anthonomus grandis), Diptera (Aedes aegypti) e Hemiptera (Euschistus heros), e ao nematoide Caenorhabditis elegans. Também foi avaliado a ação antagonista dessas cepas contra os fitopatógenos F. oxysporum f. sp. vasinfectum e Sclerotinia sclerotiorum e a solubilização de fósforo. Os resultados indicaram que houve uma diversidade de espécies patogênicas aos insetos da ordem Lepidoptera, incluindo B. thuringiensis e B. amyloliquefaciens, com taxa de mortalidade ≥ 80%. A espécie de B. atrophaeus foi patogênica ao nematoide C. elegans (85%). A espécie Priestia aryabhattai reduziu a sobrevivência de E. heros em 77%. E uma estirpe de B. subtilis (S2790) ocasionou 100% da mortalidade de A. grandis. Conclui-se que a caracterização fenotípica clássica aliada com a genética produz bons resultados, além disso esse estudo prospectou isolados com grande potencial para biocontrole e biofertilizantes destinados a agricultura sustentável.