Análise da infecção criptocócica latente e da reativação de células dormentes de cryptococcus neoformans associada ao metabolismo celular de macrófagos

Abstract

A capacidade de se manter dormente ou em estado latente é uma adaptação observada em diversas células e organismos, na qual as células reduzem seu metabolismo, transcrição e tradução, para se manterem vivas em condições não ideais para seu crescimento. Assim, elas retomam o crescimento ativo quando o ambiente volta às condições favoráveis. Tal adaptação também é observada em leveduras de Cryptococcus neoformans, fungo causador da meningite criptocócica em pacientes imunocomprometidos. Nesse trabalho analisamos os mecanismos envolvidos na reativação de C. neoformans durante infecção in vitro e in vivo e as alterações metabólicas induzidas por esse fungo nos macrófagos infectados. Para isso, infectamos macrófagos derivados de medula óssea (BMDM), pré-tratados ou não com LPS e IFN-γ com o nosso modelo de C. neoformans dormente (DCn), C. neoformans em crescimento estacionário (Stat) e mortos por calor (HK) + 1% Stat e analisamos a capacidade do DCn de reativar nessas condições e também a influência de vesículas extracelulares (EV) produzidas pelos BMDM. Para análise do metabolismo celular, analisamos a massa mitocondrial, despolarização da membrana mitocondrial, produção de espécies reativas de oxigênio (ROS), captura de glicose e ácidos graxos por citometria de fluxo. Além disso, analisamos o perfil respiratório das células infectadas por oximetria e empregamos RT-qPCR para quantificação da expressão de genes importantes no metabolismo celular. Para análise da reativação em um contexto in vivo, infectamos camundongos com fenótipo selvagem (WT) ou “Knockout” (KO) para expressão de IFN- γ ou óxido nítrico (NO), com DCn e seus respectivos controles. Observamos então, que a fagocitose é importante para estimular a reativação de DCn, apesar de não ser necessária, já que o contato com compostos extracelulares liberados pelos macrófagos é suficiente para induzir tal reativação e que esse processo é inibido na presença de LPS e IFN-γ. Observamos também que o DCn só reativou em camundongos imunossuprimidos com dexametasona (C57BL/6) deficientes na produção de IFN- γ ou em camundongos imunodeficientes na produção de linfócitos T (Balb/c nude), em que o fungo manteve sua virulência e migrou para o Sistema Nervoso Central (SNC), onde retomou sua proliferação, confirmando a importância da resposta imune adaptativa em conter essa infecção fúngica. Em relação aos aspectos metabólicos analisados, observamos que todos os fungos induziram acidificação extracelular, indicando aumento na realização de glicólise pelos macrófagos, ao mesmo tempo em que o Stat previne o aumento da captação de 2NBDG induzida pelo tratamento com LPS e IFN-γ, possivelmente representando uma estratégia ativa de evitar a ativação pró-inflamatória. Curiosamente, o DCn induz uma maior captura de ácidos graxos por macrófagos pré-tratados com LPS e IFN-γ, apesar de reduzir a dependência dos macrófagos utilizarem essa fonte de energia. Por fim, DCn modulou a expressão de genes relacionados ao metabolismo de glicose e ácidos graxos, apesar de em menor grau do que o Stat. Esses dados demonstram a preferência do DCn pela utilização de lipídeos como fonte de energia e a capacidade de modular o metabolismo do macrófago hospedeiro a seu favor, induzindo o metabolismo glicolítico nos macrófagos.