Efeito de diferentes protocolos de Percoll na qualidade espermática e na produção in vitro de embriões bovinos

Abstract

Técnicas de preparação de sêmen são usualmente utilizadas na produção in vitro de embriões (PIV) bovinos visando melhorar a qualidade espermática após o descongelamento. Dentre estas técnicas, a centrifugação em gradiente de Percoll tem sido a mais utilizada. O objetivo desse estudo foi avaliar o efeito de diferentes velocidades, tempo de centrifugação e volume de Percoll nas características espermáticas, na produção e sexo de embriões bovinos. Foram descongeladas amostras de sêmen de quatro touros, que foram submetidas a três diferentes procedimentos no gradiente de Percoll : T1 – 4 mL (volume final) de Percoll 45%:90%, centrifugados por 20 minutos a 700 g; T2 – 800 μL (volume final) de Percoll 45%:90% centrifugados por 20 minutos a 700 g e T3 – 800 μL (volume final) de Percoll 45%:90% centrifugados por por 5 minutos a 5000 g. A avaliação espermática da motilidade, morfologia, integridade de acrossoma, membrana e cromatina, foi realizada antes e após a passagem pelo Percoll. Para a PIV foram utilizados 1194 ovócitos maturados in vitro, sendo a taxa de clivagem avaliada em D2 (48h) e a taxa de blastocisto avaliada no dia 7 após fecundação (D7). Os blastocistos em D7 (n=360) foram congelados para determinação do sexo. Os dados do desenvolvimento embrionário e avaliação espermática foram analisados pela ANOVA considerando o efeito de touro, tratamento e interação touro x tratamento (P<0,05). Para analisar o sexo dos embriões utilizou-se o teste 2 com freqüência esperada de 50:50 (P<0,05). A comparação entre os tratamentos e touro também verificada pelo teste 2. Todos os tratamentos com o Percoll melhoraram significativamente a proporção de espermatozóides móveis. Não houve efeito do tratamento em nenhuma característica espermática avaliada (P>0,05), entretanto, observou-se efeito de touro. A taxa de clivagem e blastocito também não foi afetada pelos tratamentos com o Percoll. Entretanto, foi observado diferenças entre touros (P<0,05). A taxa de clivagem e blastocisto foi melhor para o touro 1 (86 ± 1,6a% e 47 ± 2,6c%) seguido do touro 2 (86 ± 2,1a% e 39 ± 6,6c%) e touro 3 (65 ± 5,9b% e 17 ± 4,1d%). O touro 4 apresentou baixa produção total de blastocisto (n=5), sendo eliminado da análise. A proporção macho:fêmea foi semelhante em todos os tratamentos para os touros 2 e 3. Apenas o touro 1 no T1 apresentou uma maior porcentagem de embriões machos (61%) em relação aos embriões do sexo feminino (39%). Quando apenas os tratamentos foram considerados, independentes dos touros, não foi verificado diferença na proporção macho:fêmea entre T1 (55:45 %), T2 (45:55 %) e T3 (44:56 %). Os resultados mostraram que a utilização de diferentes velocidades, tempo de centrifugação e volume de Percoll não influenciou a taxa de blastocisto e a relação macho:fêmea. Entretanto, para o touro 1 foi observado um desvio para produção de embriões machos quando se utilizou o T1. Esses resultados sugerem a possibilidade de utilizar um menor volume de Percoll por um período de tempo mais curto, diminuindo assim o custo e o tempo para a realização da fecundação in vitro. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT

Techniques for sperm selection are usually used for bovine in vitro embryo production (IVP) to improve semen quality after thawing. Among these techniques Percoll gradient has been the most used. The aim of this study was to evaluate the effect of different volumes of Percoll, time and force of centrifugation on sperm quality, embryo development and sex of IVP bovine embryos. Frozen-thawed semen from four bulls were submitted to three different Percoll procedures: T1 - 4 mL (final volume) of Percoll 45%:90%, centrifuged for 20 minutes at 700 g, T2 - 800 μL (final volume) of Percoll 45%:90% centrifuged for 20 minutes at 700 g and T3 - 800 μL (final volume) of Percoll 45%:90% centrifuged for 5 minutes at 5000 g. Semen was evaluated before and after Percoll treatment for sperm total motility, morphology, integrity of acrosome, membrane and chromatin. A total of 1194 oocytes were matured, fetilized and cultured in vitro, cleavage rate was valued on D2 and blastocyst rate on D7 after in vitro insemination. The blastocysts in D7 (n=360) were frozen for posterior sex determination. Data from embryo development and sperm characteristic were analyzed by ANOVA considering the effect of bull, treatment and interaction bull x treatment (P <0.05). The ratios were compared with the expected ratio 1:1 by  2 test (P<0.05). All Percoll methods significantly improved the proportion of motile spermatozoa. No effect of treatment was detected in any of the sperm characteristic (P>0.05), however bull-related differences were observed in all parameters tested. Similarly, cleavage and blastocyst rate were not affected by Percoll procedure (P>0.05). However, there was a difference among bulls (P<0.05). Sire 4 had very low embryos production (n=5), and was eliminated from the analysis. Higher rates of cleavage and blastocyst were observed for bull 1 (86 ± 1.6 a % and 47 ± 2.6 c%) and bull 2 (86 ± 2.1a % and 39 ± 6.6c %) showed than for bull 3 (65 ± 5.9b % and 17 ± 4.1d %). The proportion of male:female embryos was similar in all treatments for bulls 2 and 3. Only bull 1 in the T1 presented a greater percentage of male (61%) than female embryos (39%). When only treatments were considered, independent of bulls, no difference was found in proportion male:female (%) among T1 (55:45), T2 (45:55) and T3 (44:56). The results showed that the use of different speed, time of centrifuge and volume of Percoll gradient did not influence the rate of blastocyst and the male:female ratio. However, for bull 1 it was observed a higher production of male embryos when T1 was used. These results suggest the possibility of using a lower volume of Percoll for a shorter period of time, thus reducing the cost and time to perform the in vitro fertilization.