Caracterização e avaliação da viabilidade, dos marcadores imunitários e diferenciação de células tronco hematopoeticas humanas criopreservadas

Abstract

Introdução: As células tronco hematopoeticas (CTH) apresentam numerosas aplicações terapêuticas no tratamento de neoplasias hematológicas, doenças autoimunes e na medicina regenerativa. As características clínicas, bioquímicas e imunitárias dos indivíduos são fatores relevantes na qualidade da CTH coletada e criopreservada, interferindo assim nos resultados dos transplantes de células tronco hematopoéticas. Os meios de culturas e substratos de cultivo são modelos in vitro necessários para viabilizar as pesquisas experimentais e use terapêutico. Esse estudo buscou caracterizar e avaliar a viabilidade e os marcadores imunitários de CTH humanas, assim como, para avaliar o papel da fibrina leucoplaquetária (FLP) como substrato para o cultivo dessas. Métodos: Tratase de estudo descritivo e experimental conduzido com 14 amostras de CTH obtidas por aférese de 14 indivíduos adultos saudáveis. As amostras foram submetidas à tipagem para os antígenos do HLA pela técnica SSO e sistemas ABO/Rh por imunohematologia. A viabilidade e os tipos de morte regulada foram avaliados por citometria de fluxo. As espécies reativas foram avaliadas por citometria de fluxo (EROs/DCFDA; ERNs/DAFFM Diacetate). O potencial de diferenciação das CTH foi avaliado pela utilização de uma malha de fibrina como substrato; os resultados foram tabulados e analisados no programa Prism 5.0. Resultados: os doadores das CTH foram adultos jovens com parâmetros hematológicos e bioquímicos dentro dos valores normais de referência. O tempo de criopreservação de 34 ± 15 meses reduziu em 2% o total de CTH-CD34+. Houve maior expressão dos loci A*02, DRB1* 04, DRB1*07 para os antígenos HLA. Quanto ao tipo de morte celular regulada não houve diferença entre os percentuais de apoptose inicial, apoptose tardia e por mecanismo desconhecido. Quanto ao sistema ABO houve predomínio do tipo O (6 indivíduos), seguido pelo tipo A (5 indivíduos). Para o fator Rh houve predomínio do tipo positivo (10 indivíduos). Posteriormente à criopreservação houve grande variabilidade individual na produção de espécies reativas e maior produção de ERNs do que EROs pelo conjunto dos indivíduos. O uso da malha de fibrina favoreceu a antecipação do agrupamento celular (homing / 2 dias de incubação), enquanto na ausência da fibrina o agrupamento foi observado com 3 dias. A malha de fibrina favoreceu o surgimento de sinais de diferenciação celular (pseudópodes e nucléolo evidente) com 3 dias de incubação. Conclusão: O conjunto dos resultados mostraram que os parâmetros da criopreservação das CTH devem ser considerados para garantir a sua qualidade, pois houve redução na viabilidade das células quando descongeladas e algumas amostras tiverem metabolismo mitocondrial próximo de 0 (zero). Considerando que a malha de fibrina rica em plaquetas, proporcionou a adesão, o homing e os sinais de diferenciação celular, acredita-se que os parâmetros relacionados ao método de congelamento/descongelamento e ao tempo de criopreservação foram apropriados para garantir a qualidade das amostras de CTH. No entanto, sugere-se a continuidade dos estudos para determinar o efeito a curva de tempo x qualidade das células para auxiliar a tomada de decisão dos bancos nacionais de criopreservação de células tronco.