Micropropagação de espécies de Cyrtopodium nativas do Cerrado com potencial ornamental comparando dois métodos : meio gelificado e biorreator de imersão temporária

Abstract

As Orchidaceae são reconhecidas por suas flores de singular beleza. Em razão disso, são amplamente usadas como plantas ornamentais, seja como flores de corte ou plantas de vasos. O processo de produção de mudas se inicia com a germinação assimbiótica de suas sementes, seguido de uma fase de multibrotação e do alongamento das plantas cultivadas in vitro, e posterior aclimatização. Cada uma dessas etapas requer o uso de meio de cultivo e reguladores de crescimento adequados a cada espécie. Assim, este trabalho teve como objetivo o desenvolvimento de protocolos para todas as fases do cultivo in vitro de duas espécies de Cyrtopodium nativas do Cerrado com potencial ornamental: C. parviflorum Lindl. e C. withneri L.C. Menezes. Inicialmente foi medida a viabilidade das sementes por meio do teste do tetrazólio (TTC) em duas condições de pré-condicionamento por 24 h, embebição em água destilada ou em solução de sacarose a 10 %, e dois tipos de coloração com TTC a 1 %, diluído em água ou em tampão de fosfatos, e como controle foi feita a coloração direta em TTC a 1 % sem embebição. Após essa etapa foi realizada a germinação assimbiótica das sementes, onde foram testados três meios de cultivo Knudson C (KC) e Murashige & Skoog (MS), na concentração normal e com metade dos sais (½ MS), com e sem adição de carvão ativado (CA). Protocormos obtidos a partir da germinação assimbiótica foram cultivados em meio de cultivo sem adição de CA, em 10 combinações de ácido naftaleno acético (ANA) e 6-benzilaminopurina (BAP) a fim de verificar a melhor concentração para indução de multibrotação. Brotos oriundos da fase de multibrotação com 2-2,5 cm de altura foram alongados em dois sistemas: i. meio gelificado com e sem CA; ii. Biorreator de Imersão Temporária (BIT) com imersão por 3 minutos a cada 2, 4 ou 8 h, sem reguladores de crescimento, exceto para 8 h. Plantas então obtidas na fase de alongamento foram transferidas para casa de vegetação e cultivadas em substrato de vermiculita por 100 dias para que fossem aclimatizadas. Foram extraídas amostras de folhas de plantas ao final das fases de alongamento e aclimatização para quantificação dos teores de clorofilas e carotenoides. Amostras de folhas dessas fases também foram fixadas em FAA 50, e posteriormente foi realizada a dissociação das epidermes para contagem dos estômatos e determinação da densidade estomática. O teste de viabilidade por meio do TTC apresentou diferenças entre as espécies e entre os tratamentos utilizados, em especial quanto a embebição. O tratamento mais uniforme foi aquele com embebição em solução de sacarose a 10 % e coloração em TTC a 1 % diluído em água. A germinação ocorreu com elevado percentual nos três meios analisados, com efeito positivo da adição de CA. Entretanto, o uso do meio KC para germinação não se mostrou viável, uma vez que ocorreu a morte de praticamente todos os protocormos desenvolvidos. Cyrtopodium parviflorum mostrou preferência para a germinação em MS, enquanto que para C. withneri a preferência se deu em ½ MS, ambos os meios adicionados de CA. A fase de multibrotação apresentou elevada sobrevivência das duas espécies nas concentrações mais baixas de BAP, com redução expressiva em 2 e 4 mg/L (T7-T10). A produção de brotos também foi afetada pelo aumento na concentração de BAP, principalmente em C. parviflorum, que teve o desenvolvimento de raízes inibido em qualquer concentração empregada (0,5-4,0 mg/L). Os demais parâmetros avaliados também indicaram o efeito deletério da citocinina usada. O emprego de ANA também não mostrou ser vantajoso, já que o cultivo sem adição de reguladores de crescimento apresentou, de forma geral, os melhores resultados. A fase de alongamento apresentou diferenças contrastantes entre os dois sistemas. No sistema de BIT a mortalidade dos explantes foi quase que integral, enquanto que em meio gelificado houve sobrevivência superior a 90 %. Em meio gelificado os explantes se desenvolveram com sucesso, apresentando altura maior do que é descrito pela literatura. A aclimatização foi realizada apenas com plantas alongadas em meio gelificado com e sem CA. Cyrtopodium withneri apresentou 100 % de sobrevivência e C. parviflorum 94 %. As plantas desenvolveram completamente seus pseudobulbos, e algumas novas brotações. O substrato empregado, vermiculita, se mostrou adequado para esta etapa. Ao final dos 100 dias de aclimatização, houve diferença no tamanho das plantas, tendo C. withneri atingido o dobro da altura das plantas de C. parviflorum. Essa diferença de altura pode ser apenas a manifestação das características genéticas de cada espécie. Com isso, a aclimatização de C. parviflorum e C. withneri pode ser conduzida em casa de vegetação com 50 % de luminosidade e irrigação diária, e emprego de vermiculita como substrato. A quantificação das clorofilas e carotenoides mostrou aumento significativos desses pigmentos ao passar da fase de alongamento para o fim da aclimatização. Os teores desses pigmentos variaram durante as fases, sendo maiores para C. parviflorum ao final da aclimatização, e para C. withneri ao fim do alongamento. A densidade estomática praticamente não apresentou diferença entre as espécies e tratamentos, bem como quando comparada com plantas cultivadas em condição de campo. De forma geral, a densidade estomática das duas espécies foi elevada, sendo uma característica delas, pois na literatura há espécies com elevada densidade e outras com baixa densidade estomática. Ao final do trabalho pôde ser verificado que a produção in vitro de mudas de C. parviflorum e C. withneri pode ser realizada com sucesso com o emprego dos protocolos aqui avaliados, sendo recomendado a germinação, a multibrotação e alongamento em MS para C. parviflorum e em ½ MS para C. withneri, e aclimatização em vermiculita. O uso de reguladores de crescimento e o alongamento em BIT não são recomendados, em razão da baixa resposta das espécies a essas substâncias e ao sistema de alongamento.