Aperfeiçoamento da diferenciação de embriões somáticos em palma de óleo e avaliação anatômica e da expressão de genes envolvidos com a hiperhidricidade durante a regeneração de plantas

Abstract

O objetivo do trabalho foi aperfeiçoar o protocolo de embriogênese somática de um híbrido interespecífico de palma de óleo (Elaeis oleifera x E. guineensis) desenvolvido em sistema bifásico, a partir da melhoria das etapas de diferenciação e regeneração das plantas. Em um segundo experimento, foram avaliadas as diferenças morfológicas, anatômicas e histoquímicas de embriões somáticos normais e hiperhídricos de palma de óleo submetidos aos tratamentos com ácido giberélico (AG3). Por fim, o estudo verificou genes diferentemente expressos em embriões somáticos hiperhídricos ou não em vias de regeneração. Explantes foliares imaturos de palma de óleo do genótipo B351733 foram utilizados em meio de cultivo semissólido, suplementado com 30 g/L de sacarose e 450 μM de Ácido 4-amino-3,5,6-tricloropicolínico (Picloram), além de 2,5 g/L de carvão ativado. Para multiplicação, os calos formados foram transferidos para novo meio de multiplicação, constituído pelo meio de MS com 30 g/L de sacarose, 5 μM de Picloram, 20 μM de 2-isopenteniladenina (2iP) e 2,5 g/L de carvão ativado, onde permaneceram por 90 dias. Em seguida, os calos foram colocados para a diferenciação de embriões somáticos, em meio de cultivo de MS com sacarose 30 g/L, 1 g/L de caseína hidrolizada, 0,25 g/L de glutamina, asparagina, arginina e cisteína, além de 2,5 g/L de carvão ativado e três concentrações de AG3 (0, 0,5 e 1,0 mg/L), onde permaneceram por até 210 dias. Os embriões somáticos diferenciados e que apresentavam início de germinação foram então transferidos para o meio líquido para a regeneração, composto pelo meio de MS1/2, suplementado com 30 g/L de sacarose, 1,0 g/L de caseína, 0,25 g/L de glutamina, asparagina, arginina e cisteína, 1,0 g/L polivinilpolipirrolidona (PVP) e duas concentrações de ácido indolbutírico (AIB): 1,5 e 11 mg/L. Por fim, análises de fidelidade genética foram realizadas para avaliar a estabilidade genética do material regenerado através de marcadores ISSR utilizando as folhas de plantas clonais regeneradas. Para as análises morfológicas, anatômicas e histoquímicas, embriões somáticos oriundos do meio de diferenciação e apresentando aspecto normal (Nm) e hiperhídrico (Hh) foram fotografados, emblocados e corados para avaliação, além de terem sido observados e comparados em microscopia eletrônica. Para os estudos da expressão gênica, embriões somáticos normais e hiperhídricos do tratamento controle e do tratamento que proporcionou os melhores resultados para a diferenciação de embriões somáticos foram aleatorizados, selecionados e avaliados . Um total de 19 genes potencialmente envolvidos na hiperhidricidade foram selecionados para as análises. Verificou-se que o tratamento com 1,0 mg/L de AG3 melhorou significativamente a taxa de diferenciação (86,2%) e também na germinação (38,4%) de embriões somáticos, quando comparado ao tratamento controle, sem a presença de AG3 (41,7% e 17,1%, respectivamente). Os embriões somáticos que germinaram apresentaram uma porcentagem de enraizamento maior no tratamento com 11 mg/L de AIB (37%), quando comparado a taxa de enraizamento do meio com menor quantidade de auxina (20%). Com relação às análises de estabilidade genética realizadas, verificou-se diferenças em 13,3% das plantas analisadas. Quando se avaliou anatômica e histoquimicamente os embriões somáticos Nm e Hh, verificou-se maior acúmulo de proteínas e amido nos embriões somáticos Nm, quando comparado aos Hh que não apresentaram reservas de amido. No estudo de expressão gênica, os resultados revelaram que dos 19 genes testados, 17 deles apresentaram expressão gênica diferencial nos embriões hiperhídricos. Os genes envolvidos na resposta de estresse, metabolismo energético, defesa, transporte por membrana, regulação hormonal e desenvolvimento apresentaram-se regulados positivamente, com destaque para a síntese e transporte de etileno. Conclui-se que a adição de AG3 ao meio de cultura melhora as taxas de diferenciação e regeneração de embriões somáticos em palma de óleo, embora também aumentem a ocorrência de embriões somáticos vitrificados. A principal característica avaliada de forma histoquímica e da expressão de genes deste tipo de formação foi a deficiência em acumular amido e apresentar a maioria dos genes envolvidos com esse fenômeno aumentados.