Modelagem estrutural e análises in silico e in vitro da catepsina b de Trypanosoma cruzi

Abstract

A doença de Chagas tem como agente etiológico o parasito intracelular obrigatório Trypanosoma cruzi e acomete aproximadamente 7 milhões de pessoas no mundo sendo endêmica em países da América Latina. A doença caracteriza-se ainda como negligenciada por não possuir tratamento eficaz para os casos durante a fase crônica, bem como cura e por afetar, em sua maioria, a população de baixa renda. Em vista disso, é necessária a descoberta de fármacos mais eficazes e seguros com novos mecanismos de ação. Nesse contexto, a catepsina B destaca-se como uma císteíno protease essencial em outros organismos pela sua atuação no processo infeccioso. Embora já tenha sua atividade enzimática estudada, abordagens de estrutura e função da catepsina B de T. cruzi (CatBTc) não haviam ainda sido exploradas. Este trabalho, portanto, teve como objetivo a elucidação das funções da catepsina B de T. cruzi por meio de análises in silico e in vitro. Dessa forma, desenvolvemos e avaliamos modelos tridimensionais da CatBTc. A partir do melhor modelo obtido, realizamos uma triagem virtual da biblioteca de compostos do Museu Nacional de História Natural de Paris, por meio de cálculos de docking molecular e outras abordagens computacionais para priorizar compostos potenciais inibidores de CatBTc para posterior validação in vitro. Por fim, a obtenção da proteína recombinante expressa em E. coli e do nocaute duplo dos alelos presentes nas cepas CL Brener e Y utilizando o sistema CRISPR/Cas9 foram explorados com a finalidade de realizar a sua análise funcional. Assim, foi possível se obter dois modelos tridimensionais computacionais da protease provenientes de servidores diferentes que foram submetidos a cálculos de docking com a seleção 19 compostos promissores. A proteína recombinante foi expressa e purificada nas frações solúvel e insolúvel com sucesso, contudo, não apresentou atividade. A primeira tentativa de nocaute gênico resultou na morte e dificuldade de seleção de parasitos mutantes possivelmente devido importância do gene para a sobrevivência do parasito.