Clonagem e expressão de L-asparaginase de Fusarium proliferatum em Escherichia coli

Abstract

A L-asparaginase é uma enzima utilizada para tratamento da Leucemia Linfoblástica Aguda, que atinge em sua maioria crianças e adolescentes, e possui a capacidade de hidrolisar a L-asparagina em L-aspartato e amônia. As preparações clínicas dessa enzima são derivadas de fonte procariota e seu uso está frequentemente associado a reações adversas graves. O Brasil vem, já há alguns anos, importando este medicamento para uso nacional devido à falta de produção no país. Uma alternativa para a enzima que se encontra no mercado seria a clonagem e expressão de L-asparaginase de Fusarium proliferatum em Escherichia coli, com objetivo de atenuar os efeitos adversos produzidos por ser uma enzima de origem procariótica. Tendo isso em vista, o objetivo desse trabalho foi realizar a clonagem de L-asparaginase obtida por Fusarium proliferatum e expressá-la em Escherichia coli BL21(DE3). Foi realizada a síntese do gene da L-asparaginase de F. proliferatum em vetor pET-28a(+) com otimização de códons para E. coli e sítios de restrição NdeI/XhoI. Em sequência, foi realizada transformação para replicação em E. coli DH10B e transformação para expressão em E. coli BL21(DE3). Após a confirmação da inserção do vetor no sistema de expressão, foram selecionados clones para serem avaliados quanto à produção de L-asparaginase, com posterior avaliação do crescimento microbiano, métodos de rompimento celular e screening para avaliar algumas condições de cultivo, com variação da concentração do indutor IPTG, tempo pós indução e temperatura de indução. As frações solúvel e insolúvel foram utilizadas para a realização do ensaio enzimático, onde a atividade de L-asparaginase foi medida pelo método de Nessler e do ß-hidroxamato aspártico. A melhor metodologia para lise celular consistiu em 10 ciclos de sonicação, sendo cada ciclo composto por 1 segundo ON e 1 segundo OFF, e intervalo de 1 minuto entre cada ciclo. Dentre as variáveis analisadas em relação ao cultivo e indução, o crescimento bacteriano a 37 ºC por 2h30, com indução por IPTG 0,5 mM, temperatura de indução de 20 ºC e tempo pós indução de 12 horas representou a melhor condição para expressão da enzima. Ambas metodologias de quantificação enzimática, após concentração das frações, apresentaram atividade de L-asparaginase na fração solúvel, sendo 0,449 UI/mL pelo método de Nessler e 0,082 UI/mL pelo método do AHA.