Efeito do Atazanavir, da Curcumina e do Lopinavir nas vias canônica e não canônica do NF-kB determinantes de resposta inflamatória em neuroblastoma SK e em células mononucleares do sangue periférico de gestantes incubadas in vitro com o vírus Zika

Abstract

INTRODUÇÃO: O vírus Zika é um flavivírus que pode causar microcefalia em humanos. O fator de transcrição nuclear NF-κB regula a inflamação, a sobrevida celular e a resposta imune, e é ativado pelas vias canônica ou não canônica. O atazanavir, curcumina e lopinavir têm mostrado efeitos moduladores sobre o NF-B, podendo interferir na progressão das respostas imunes das células mononucleares do sangue periférico (CMSP) de gestantes e de neuroblastomas (NB). OBJETIVO: O objetivo desse trabalho foi avaliar o efeito do atazanavir, curcumina e lopinavir nas vias canônica e não canônica do NF-κB, e a produção de citocinas e quimiocinias em células de NB e em CMSP de gestantes e não gestantes, incubadas in vitro com o Zika. MATERIAIS E MÉTODOS: Avaliou-se os efeitos da incubação in vitro com o Zika e do tratamento com o atazanavir, curcumina e lopinavir na expressão dos receptores para o TNF (rLTX, r1TNF e r2TNF) e das moléculas da via do NF-B em NB e CMSP de não gestantes e gestantes. A produção de citocinas inflamatórias e imunológicas foi quantificada por citometria de fluxo. Os grupos de estudo foram: Controle, incubados com o Zika, tratados com atazanavir, tratados com atazanavir e incubados com o Zika, tratados com curcumina, tratados com curcumina e incubados com o Zika, tratados com lopinavir e tratados com lopinavir e incubados com o Zika. A adsorção do Zika foi feita após 30 min de incubação das células e os tratamentos iniciaram após 1 h de adsorção do vírus, permanecendo em tratamento por 6 h. Foram avaliados os receptores para linfotoxina (rLTX) e receptores para o TNF (r1TNF e r2TNF), as moléculas FADD, TRAF, NIK, JNK, IB, p50, p52, p65 relA, relB e c-Rel nas células de NB e monócitos, além das citocinas imunes e inflamatórias: TNF, IFN-γ, IL-12p70, IL-2, IL-10, IL-4, IL-17A, IL-8 e IL-1 nos sobrenadantes das culturas dos NBs e CMSP; e as quimiocinas: CXCL8/IL-8, RANTES, CXCL9/MIG, CCL2/MCP-1; CXCL10/IP-10 nos sobrenadantes das culturas das CMSP. As analises foram feias pelos testes de ANOVA ou Kruskal-Wallis, ANOVA para medidas repetidas ou Friedamn, teste t ou MannWhitney, segundo as indicações e significante para p<0,05. RESULTADOS: Observou-se partículas do Zika no citoplasma dos NB por microscopia eletrônica de transmissão. O atazanavir inibiu o crescimento do Zika entre 6 e 24 horas após a incubação, a curcumina reduziu o crescimento do vírus nas primeiras 6 horas após a incubação e o lopinavir reduziu o crescimento do vírus entre os primeiros períodos após a infecção. O NB apresentou constitutivamente no grupo controle maior expressão do rLTX. Nos grupos incubados apenas com o Zika, e os grupos atazanavir+zika, curcumina, curcumina+zika, lopinavir e lopinavir+zika houve maior expressão do r2TNF. Nos monócitos, as não gestantes apresentaram em todos os grupos maior expressão do r1TNF e as gestantes o rLTX. No NB, a molécula FADD foi mais expressa que a molécula TRAF em todos os grupos, sendo c-Rel a de maior expressão das moléculas finais da via. No controle (basal), o NB expressou constitutivamente o rLTX, FADD, NIK, IkB e c-Rel, com produção de IL-8 e IL-6. Nas não gestantes, o r1TNF foi o de maior expressão e nas gestantes, o rLTX, como também a produção de IL-6, IL-8, IL-1β, TNF e as quimiocina MCP-1 e RANTES. Na incubação com o Zika, houve maior expressão do c-Rel nos NBs e menor expressão de relB, com produção aumentada de IL-8 e IL-6. Nas CMSP houve maior expressão do relA em não gestantes, e maior produção de IL-8, TNF, MCP-1 e nas gestantes, maior produção de IL-8, IL-6, TNF e IL1β. No tratamento com o atazanavir, nos NBs, o c-Rel continuou mais expresso, porém notou-se aumento na expressão da molécula p52, com redução de IL-6, mantendo os níveis de IL-8. Nos monócitos, as não gestantes apresentaram maior expressão da p52, e nas gestantes, maior expressão do relA, com aumento na produção de IL-8. No grupo atazanavir+zika, para os NBs, o c-Rel continuou a ser a molécula mais expressa, porém, houve aumento do p52 e nos monócitos, o relA foi mais expresso nas não gestantes e gestantes, com aumento de IL-8 e IL-1β. No tratamento com a curcumina, o c-Rel foi mais expresso pelo NB, com aumento da molécula p52 e do relA e redução da IL-6 e IL-8 e nos monócitos, as gestantes e não gestantes expressaram relA. No grupo curcumina+Zika, os NBs expressaram o c-Rel, relA e p52 e os monócitos relA, em não gestantes, que aumentaram IL-8 e IL-1β, e em gestantes, que produziram mais IL-6, IL-8 e IL-1β. No tratamento com o lopinavir, os NBs expressaram mais c-Rel, com redução de IL-6 e as gestantes continuaram a expressar o relA mais elevado. No grupo lopinavir+Zika, os NBs expressaram c-Rel e p52 e nas CMSP, as gestantes aumentaram o relA e IL-8. CONCLUSÕES: Confirmamos que o Zika infecta os NBs. O atazanavir, a curcumina e o lopinavir apresentaram uma ação direta reduzindo o crescimento do Zika. A ativação do NF-B foi sugestiva da via não canônica nos NB e nos monócitos de gestantes, por expressarem o rLTX, porém as moléculas ativadas juntamente com esse receptor, mostraram um perfil que tende para a via canônica e a incubação com o vírus mostrou que os NBs tendem a uma resposta pelo r2TNF, com perfil canônico. Os monócitos de não gestante expressaram o r1TNF, com ou sem infecção viral, o que sugere uma resposta canônica. As citocinas detectadas e que também sofreram variação têm perfil de ativação canônico. As drogas não afetaram o tipo de resposta, mas atuaram na intensidade responsiva das células. Nossos dados indicam que todas as drogas estudadas foram promissoras e particularmente o atazanavir, que causou uma importante inibição do crescimento do Zika, e deve ser melhor avaliada pela possibilidade de reaproveitamento para o tratamento precoce da infecção pelo Zika, para evitar a microcefalia.