Caracterização da atividade ligante e da função efetora de anticorpos humanizados Anti–CD3 humano

Abstract

O anticorpo anti-CD3 tem sido utilizado como imunoterápico na prevenção da rejeição a órgãos transplantados e considerado um fármaco promissor para o tratamento de doenças auto-imunes. Entretanto, o único anticorpo anti-CD3 utilizado para uso clínico aprovado pelo FDA, o OKT3, possui origem murina o que gera uma resposta imunogênica quando administrado, impossibilitando uma utilização prolongada e, assim, diminuindo sua eficácia. Uma técnica que vem ao encontro da solução desse problema é a humanização de anticorpos, que por meio de manipulações gênicas propicia um aspecto “mais humano” a essa molécula, atenuando a resposta imunogênica desencadeada. Nesse sentido, foi avaliada a atividade ligante e a função efetora de duas versões humanizadas do anticorpo anti-CD3 apresentando o resíduo murino treonina (T) ou o resíduo humano arginina (R) na posição 86 da cadeia variável pesada. Posição essa, considerada importante estruturalmente. Para expresão dos anticorpos humanizados foram construídos vetores de expressão dicistrônicos, os quais foram utilizados para produção das imunoglobulinas em células de mamíferos da linhagem CHO, de forma estável. Os anticorpos produzidos foram purificados por cromatografia de afinidade para posterior análise da atividade ligante e da função efetora. Os resultados indicam que os anticorpos humanizados são capazes de se ligar ao CD3 na superfície de linfócitos. Contudo, são incapazes de bloquear completamente a ligação do anticorpo murino OKT3 à superfície de linfócitos, em ensaios de competição. Em conjunto com análises estruturais, esses dados indicam uma perda de afinidade das versões humanizadas provavelmente devido à substituição de resíduos importantes estruturalmente na cadeia leve humanizada. As versões humanizadas também apresentam uma capacidade mitogênica menor que a apresentada pelo OKT3, corroborando a perda de afinidade desses anticorpos. Esses dados sugerem que os anticorpos humanizados são capazes de se ligar ao CD3 na superfície de linfócitos, mas o processo de humanização levou a uma diminuição da afinidade original desses anticorpos. Nesse sentido, para se restabelecer a atividade ligante dos anticorpos recombinantes sugerimos a realização de algumas mutações específicas para com isso avaliar o seu futuro uso clínico. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT

Anti-CD3 antibodies have been used for the prevention of organ allograft rejection and are also considered a promising immunotherapic for autoimmune diseases treatment. Currently, there is only one anti-CD3 antibody approved by FDA for clinical use, the OKT3. Unfortunately, due to its murine origin, it promotes an immunogenic reaction when administrated, limiting its long-term use and reducing the treatment effectiveness. To solve this problem we have proposed humanized versions of this anti-CD3 to avoid its immunogenic properties. In this work was evaluated the binding activity and effector function of two humanized anti-CD3 antibodies. The first one has the murine residue threonine (T) 86 VH position while the second version shows the human residue arginine (R) at position 86 in VH. Modeling analysis indicated that this position is structurally important. To express the recombinant antibodies we constructed a dicistronic expression vector and produced the immunoglobulins in CHO cell lines. To analyze the binding activity and effector function, the recombinant proteins were previously purified by affinity chromatography. The results show that humanized antibodies were able to binding to the human CD3 on the T lymphocyte surface. However, they weren’t able to completely block OKT3 binding to T lymphocyte surface on competitive assays. Along with structural analysis, this data indicate an affinity loss of humanized versions probably due the substitution of important residues on humanized VL. The humanized versions also presented a less mitogenic activity than that observed by OKT3, corroborating the affinity loss of these antibodies. These data suggest that the humanized antibodies are able to bind to human CD3, but the humanization procedure caused a decrease on recombinant antibody affinity, compared with OKT3. To restore the binding activity of these antibodies specific mutations and back mutations must have to be taken in order to permit its future clinical use evaluation.