Desenvolvimento do algoritmo X-Tox para reposicionamento in silico de fármacos contra Mycobacterium tuberculosis e prova de conceito in vitro dos efeitos bactericidas e bacteriostáticos dos fármacos Orlistat, Carvedilol e Otilônio

Abstract

Considerando a prevalência da tuberculose mundialmente, o aumento da resistência bacteriana e a falta de medicamentos inovadores no mercado, faz-se necessário o desenvolvimento de pesquisas que sejam capazes de enfrentar as dificuldades citadas. A utilização de metodologias in silico para o reposicionamento de fármacos tem sido capaz de diminuir falhas, tempo e recursos apresentados durantes as fases I e II da pesquisa clínica, visto que é capaz de realizar uma rápida varredura de milhares de moléculas contra um determinado alvo, otimizando o descobrimento ou o reposicionamento de novas terapias. Em estudo prévio, foi possível identificar uma série de fármacos passíveis de reposicionamento a partir da docagem molecular de milhares de moléculas aprovadas para uso no mercado com uma proteína transmembrana (MmpL3) e duas enzimas de Mycobacterium tuberculosis, a saber, RNA-polimerase, alvo da Rifampicina e Enoil-ACP-redutase, alvo da Isoniazida. Posteriormente, foi realizada uma análise in silico da toxicidade dos fármacos selecionados utilizando o software Nexus da Lhasa®. A partir das informações obtidas pelo programa e complementadas com dados de bases externas, foi desenvolvido um algoritmo e, consequentemente, um novo ranking dos fármacos foi determinado levando em conta a toxicidade. Como resultado, foram selecionados cinco fármacos (Carvedilol, Cetoconazol, Daclatasvir, Orlistate e Otilônio) com baixo risco toxicológico e com potencial de interação com M. tuberculosis para os estudos in vitro. Estes fármacos foram testados de forma individual e em associação com fármacos utilizados comumente na terapêutica da tuberculose contra as cepas H37Rv, CDC 1551, Erdman, mc26230 e XDR de M. tuberculosis para ensaios de MIC (minimum inhibitory concentration), FICI (fractional inhibitory concentration index), ensaio de Kill-kinetics, capacidade de indução de resistência e internalização com macrófagos. O estudo de MIC revelou que o Carvedilol, Orlistate e Otilônio foram os mais promissores individualmente e, durante o estudo de FICI, foi identificado que todos os três obtiveram sinergismo de atividade com pelo menos um dos fármacos padrão para tratamento da tuberculose. O estudo de kill-kinetics demonstrou que as associações ORL/INH, ORL/RIF, ORL/BED, CAR/INH e CAR/BED obtiveram efeito bactericida ao longo de 30 dias de tratamento e que o OTI demonstrou atividade bacteriostática em associações com INH e BED. Mais além, foi verificado que mesmo após a bactéria ser fagocitada por macrófagos, os fármacos ORL e CAR continuaram demonstrando atividade antimicobacteriana. Em experimento de indução de mutação espontânea, ORL demonstrou baixa capacidade de gerar resistência, enquanto CAR não demonstrou nenhum crescimento de cepas espontâneas. Em suma, a presente tese avaliou, utilizando ferramentas in silico e in vitro, os fármacos ORL, CAR e OTI disponíveis no mercado para reposicionamento contra M. tuberculosis, determinando que estes possuem atividade contra cepas sensíveis e resistentes de Mtb, sinergismo com fármacos de primeira e segunda linha da terapia contra TB, atividade bactericida (ORL e CAR) e bacteriostática (OTI), baixa capacidade de gerar resistência, e atividade intracelular, fornecendo assistência ao combate dessa doença secular.