Avaliação dos efeitos do anticorpo monoclonal, infliximabe, na cicatrização de anastomoses colônicas : estudo experimental em ratos

Abstract

A cicatrização das anastomoses do tubo digestivo depende de variáveis, como técnica cirúrgica, fatores locais e sistêmicos, condições gerais do paciente e uso de agentes farmacológicos, com conseqüente variação na freqüência de deiscência das anastomoses. Drogas antiinflamatórias podem prejudicar a cicatrização das anastomoses, interferindo na etapa inflamatória da cicatrização. O objetivo deste estudo experimental foi avaliar os possíveis efeitos do infliximabe, um anticorpo monoclonal quimérico, humanomurino, com ação anti-TNF-α, no processo de cicatrização de anastomoses colônicas em ratos. Foram utilizados 60 ratos (Rattus norvergicus), distribuídos aleatoriamente em dois grupos de 30 cada. Ambos os grupos foram posteriormente randomizados em três subgrupos de dez animais, de acordo com o dia pós-operatório (DPO) de eutanásia (3º, 7º ou 14º). No grupo de estudo (E), foi administrado infliximabe na dose de 5 mg/kg, via subcutânea, 48 horas antes da operação e no grupo controle (C) foi administrado solução de NaCl a 0,9%, volume equivalente. Após laparotomia, os animais de ambos os grupos foram submetidos à secção do cólon e imediata anastomose término-terminal. Os animais foram reoperados no 3º, 7º e 14º DPO. Realizado ressecção de um segmento colônico de 4 cm, contendo a anastomose e dividido longitudinalmente em dois segmentos semelhantes. Um dos segmentos foi ao acaso designado para teste de resistência tênsil e outro para estudo histológico e de deposição do colágeno, após processamento e coloração com hematoxilinaeosina, tricrômico de Masson e Picro-Sirius. A deposição do colágeno foi avaliada por digitalização de imagens e calculada através do software Image J. Foi coletado sangue, por punção, da veia cava inferior para quantificação do TNF-α sérico, pelo método ELISA, utilizando-se um kit específico para ratos. A concentração tecidual do TNF-α foi avaliada por imunohistoquímica. Os animais que receberam o infliximabe perderam peso nas 48 horas entre a administração da droga e a operação, enquanto que no grupo controle os animais ganharam peso no mesmo período. Houve três óbitos no grupo estudo e um no grupo controle, sem que esta diferença tenha significância estatística e que se possa relacionar com o uso do infliximabe. Todos os animais, de ambos os grupos perderam peso no pós-operatório, porém observou-se que no 14º DPO os ratos recuperaram o peso perdido. A resistência tênsil das anastomoses foi maior, estatisticamente significante, no grupo estudo, no 14º DPO, enquanto não houve diferenças significantes no 3º e 7º dias. Não houve diferenças estatisticamente significativas entre os grupos na avaliação histológica bem como na histomorfométrica. Na avaliação do TNF-α sérico por ELISA houve diferença estatisticamente significante entre os subgrupos C3 e E3 (3º DPO) e entre o grupo de referência e C3. Não houve diferença no TNF-α tecidual avaliado por imunohistoquímica. O TGF-β tecidual foi maior no subgrupo E14 quando comparado com o subgrupo C14 (14º DPO). O estudo sugere que a administração subcutânea do infliximabe foi efetiva, exeqüível e segura. Nas condições que foi realizado este estudo o infliximabe interferiu na fase inflamatória caracterizando-se por redução na concentração de colágeno e melhorou a resistência tênsil das anastomoses na fase de remodelação. _____________________________________________________________________________________ ABSTRACT

It has been well established that several factors affect healing of colonic anastomosis, resulting in the rise of morbidity and mortality rate. Drugs such steroids and anti-inflammatory non-steroids impair anastomotic healing, by affecting the inflammatory step. The aim of this experimental study was to evaluate the effects of infliximab, the mouse/human IgG1 chimeric anti-TNF-α monoclonal antibody, on the healing process of colonic anastomosis in rats. Sixty male Wistar rats were used, and were randomized in two groups of 30 each. Both groups were further randomized in to three sub-groups, each of ten animals, according with the post-operative day of sacrifice (third, seventh and fourteenth). The study group was subjected to infliximab subcutaneously administered at a dose of 5 mg/kg of body weight and the control group was subjected to 0.9% sodium chloride (NaCl) solution subcutaneously administered at volume equivalent dose to infliximab, 48 hours prior to surgery. Both groups underwent to colonic section followed by an immediate endto- end anastomosis. Lots of five animals were killed in each session on post-operative days 3, 7 and 14. A colonic segment of 4 cm containing the anastomosis in its mid portion was resected, and divided longitudinally in two. One of these segments were stained with hematoxilin-eosin, Masson’s tricromic and picrosirius red and examined by light microscopy. Deposition of collagen was evaluated by image digitalization and calculated by specific software (Image J). In the other segment of the colon, anastomotic breaking strengths were assessed using a tensiometer. Blood samples were collected from the inferior vena cava and underwent an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for quantitative detection of rat TNF-α. Imunohistochemistry techniques were used for tissue evaluation of TNF-α and TGF-β. There were 3 deaths in the infliximab group and one in the saline group and there was no statistical significance in this difference and we cannot state the deaths as related to infliximab. All animals that received infliximab lost weight prior to operation while all whom received saline solution gained weight in the same period of time. Animals of both groups lost weight in post-operative period but by the fourteenth post-operative day there were a tendency to recover the lost weight. The anastomosis breaking strength was significantly higher in the infliximab group by the fourteenth postoperative day while there were no differences by days 3 and 7. There were no significantly differences between the groups in the histology and morphometric evaluation. There were statistic significant difference between infliximab and control groups on post-operative day 3 and reference group and control group on post-operative day 3, when serum TNF-α was measured by ELISA. There were no significantly differences in tissue TNF-α evaluation by imunohistochemistry. TGF-β concentrations were higher in infliximab group on postoperative day 14 as compared with controls. This study suggests that the subcutaneous administration of the infliximab was effective, feasible and safe. In the conditions this research was done, the infliximab interfered in the inflammatory step of anastomotic healing characterized by reduction on collagen concentration and improvement in anastomotic breaking strengths in collagen remodeling step.