Análise citopatológica de células de inseto infectadas com baculovírus mutantes

Abstract

Avanços nas técnicas de cultura de células têm possibilitado o isolamento e precisa caracterização de baculovírus mutantes. A maioria desses mutantes é derivada do vírus AcMNPV (Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus), principalmente pela sua facilidade de propagação e estabilidade em cultura de células. Durante a rotina de purificação de um baculovírus recombinante, dois vírus mutantes derivados de AcMNPV, o vSynlitx1B12P (MutPolh) e o vSynlitx1G4 (MutApo) foram isolados (dados não publicados). A infecção pelo MutPolh não resultava na produção de poliedros e diferia da infecção tipo selvagem pela presença de massas protéicas dispersas no citoplasma. Para explicar esse fenótipo, o vírus MutPolh foi previamente investigado e análises moleculares revelaram uma mutação pontual no gene da poliedrina. Esse gene é altamente conservado entre os baculovírus e mudanças em sua seqüência nucleotídica podem levar à formação de poliedros mutantes, morfologicamente distintos do tipo-selvagem. O outro vírus mutante, o MutApo, mostrou induzir rápida e massiva morte nas células por ele infectadas. Esse mutante também foi investigado através de técnicas moleculares e foi encontrada uma inserção de DNA interrompendo um gene inibidor de apoptose (p35). Neste trabalho analisaram-se os efeitos citopatológicos desses dois mutantes em células de inseto das linhagens Sf-21 e Tn-5B. Estudos estruturais e ultraestruturais confirmaram os resultados das análises moleculares prévias feitas para esses mutantes. As observações ultra-estruturais feitas em células infectadas pelo MutPolh submetidas a imunomarcação mostraram que os agregados protéicos encontrados no citoplasma dessas células eram, de fato, acúmulo de poliedrina não cristalizada. Ainda, o mutante MutApo mostrou induzir eventos característicos da apoptose nas células dessas linhagens. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT

Advances in cell culture techniques allowed the isolation and precise characterization of baculoviruses mutants. The majority of these mutants is derived from the virus AcMNPV, mainly due to its facility of propagation and stability in cell culture. During the purification routine of a recombinant baculovirus, two mutants derived from AcMNPV, vSynlitx1B12P (MutPolh) and vSynlitx1G4 (MutApo) were isolated (unpublished). The insect cell by the MutPolh did not result in polyhedra production and differed from wild-type infection by the presence of proteinaceous masses dispersed in the cytoplasm. To explain this phenotype, the virus MutPolh was previously investigated and molecular analysis revealed a point mutation in the polyhedrin gene. This gene is highly conserved among baculoviruses and changes in its nucleotide sequence may lead to mutant polyhedra, morphologically different from the wild-type. The other mutant virus, MutApo, was show to induce quick and massive cell death in infected cells. This mutant was also investigated and was found a DNA insertion interrupting an inhibitor of apoptosis gene (p35). In this work, the cytopathologic effects induced by these two mutants in Sf-21 and Tn-5B insect cell lines were analyzed. Structural and ultrastructural studies confirmed the findings of the molecular analysis previously done for these mutants. The observation of MutPolh-infected cells revealed that the proteinaceous aggregates found in the cytoplasm were, actually, accumulation of uncrystalized polyhedrin. Observations of cells infected by the MutApo mutant also confirmed previous information, showing that this mutant induces characteristic apoptosis events in these insect cell lines.