Animais transgênicos utilizados como biorreatores

Abstract

A crescente demanda por biomoléculas de interesse farmacológico tem levado ao desenvolvimento de sistemas adicionais para a sua produção em larga escala e sob custos mais reduzidos. Sistemas de expressão utilizando células de eucariotos superiores vêm sendo apontados como possíveis alternativas para a produção de proteínas de interesse farmacológico (Leite, 2000). A secreção desses polipeptídeos no leite de animais transgênicos possibilita não apenas altos rendimentos de produção de fármacos heterólogos como também a ocorrência de seu processamento e modificações pós-traducionais de modo correto (Kerr et al., 1996). De maneira complementar, a produção desse tipo de biomolécula em sistemas eucariotos tem apresentado características interessantes tanto com relação à manutenção de seu processo de síntese, enovelamento e processamento, quanto à significativa redução de custos, aumento de estabilidade, manutenção de atividade biológica e ausência de contaminantes e patógenos comuns aos humanos (Kusnadi et al., 1997). O fator IX de coagulação sangüínea é uma glicoproteína da classe das serino-proteases que apresenta massa molecular de aproximadamente 55kDa. O polipeptídeo é sintetizado no fígado e secretado posteriormente no sangue, em que participa de uma cascata complexa de reações envolvendo mais três fatores de coagulação e duas proteínas: a pró-trombina e o fibrinogênio, culminando à coagulação sangüínea (Thompson et al., 1986). Alterações genéticas que ocasionam a disfunção ou a ausência de síntese do FIX resultam na hemofilia B, doença recessiva ligada ao cromossomo X que afeta cerca de 1 em cada 10.000 homens no Brasil. No presente trabalho foram desenvolvidas linhagens de camundongos (Mus muscullus) transgênicos, microinjetados com o gene do fator IX de coagulação humana. As camundongas fundadoras, bem como suas progênies secretaram no leite o FIX recombinante (3% proteínas solúveis totais). A integração estável do transgene - sob controle do promotor da ?-caseína do leite - foi verificada por southern blot, e a presença do FIX no leite de fêmeas transgênicas verificada por western blot. Testes de atividade da proteína recombinante em amostras de sangue de hemofílicos do tipo B foram realizados com auxílio de coagulômetro, comprovando a bioatividade da proteína. A expressão do fator IX de coagulação humana biologicamente ativa em camundongos transgênicos (Eyestone, 1994; Damak et al., 1996; Lisauskas et al., 2008) justifica a aplicabilidade dos sistemas em bovinos transgênicos utilizados como biofábricas (Lisauskas et al., 2007; Iguma et al, 2005). ______________________________________________________________________________ ABSTRACT

The increasing demand for production of pharmaceutical interest recombinant proteins has been the goal for the development of additional systems to its production on a large scale and reduced costs. Eukaryotes expression systems are possible alternatives to the production of recombinant protein (Leite, 2000). The secretion of these polypeptides in the milk of transgenic animals promised high level of heterologous pharmaceutical products as well as the correct process and post-translation modifications (Kerr et al., 1996). The production on eukaryotic systems has presented characteristic interesting in such a way with regard to the maintenance of its process of synthesis, envelopment and processing, and to the significant reduction of costs, increase of stability, maintenance of biological activity, absence of contaminants and pathogens to the humans (Kusnadi et al., 1997). Blood coagulation factor IX is a serine-protease glycoprotein and it presents molecular mass of 55kDa. The polypeptide is synthesized in the liver and secreted in the blood, where it participates of reactions group involving coagulation factors and proteins that permit the blood coagulation (Thompson et al., 1986). Genetic alterations that cause the dysfunction or the absence of synthesis of the FIX lead to the hemofilia B, a recessive illness linked to chromosome X which affects about 1 in each 10,000 men in Brazil. In this work two lineages of mice (Mus muscullus) were microinjected with the human coagulation factor IX gene. The founding females and its progenies secreted the recombinant FIX in their milk (3% Total Soluble Protein). The stable integration of transgene - under control of the milk -casein pBC1 promoter - was confirmed by southern blot analysis. The presence of the FIX recombinant protein in the milk of transgenic females was verified by western blot. Tests of its activity in B hemophilic blood samples were confirmed by coagulometer pattern, validating this heterologous system.