Análise da expressão gênica de potenciais fatores de virulência do fungo Paracoccidioides brasiliensis submetido a diferentes condições experimentais

Abstract

O fungo Paracoccidioides brasiliensis é o agente etiológico da paracoccidioidomicose, a micose sistêmica de maior prevalência na América Latina. O mecanismo mais importante de defesa do hospedeiro contra infecções por P. brasiliensis é a resposta imunológica celular. Esse fungo é capaz de sobreviver e se replicar no interior de macrófagos murinos e humanos, revelando a existência de mecanismos que permitam a sobrevivência no ambiente inóspito do fagossomo da célula hospedeira. Em concordância com essa habilidade de P. brasiliensis em sobreviver nesse ambiente de carência nutricional, estresse oxidativo e baixo pH, análises do transcriptoma desse fungo revelam ortólogos a potenciais genes de virulência de outros microrganismos patogênicos. Nesse contexto, esse trabalho descreve a análise da expressão de potenciais genes de virulência de P. brasiliensis por RT-PCR. Visando a avaliar a expressão dos genes icl1 (isocitrato liase) e mls1 (malato sintase), que codificam as enzimas do ciclo do glioxalato, leveduras de P. brasiliensis foram crescidas em condições que potencialmente mimetizam às encontradas no interior do fagossomo, substituindo-se glicose por acetato como única fonte de carbono. Os resultados sugerem um significativo aumento na expressão de icl1 e mls1 quando do cultivo do fungo em meio contendo apenas acetato. A mesma análise foi feita para os genes ady2, que codifica uma permease de acetato, e icl2, que parece codificar outra isoforma da enzima isocitrato liase. Entretanto, os resultados indicam que os genes ady2 e icl2 de P. brasiliensis são regulados independentemente das fontes de carbono utilizadas nesse trabalho. Ainda, a expressão de ure1 (urease) foi analisada quando do cultivo de P. brasiliensis em pH ácido. Esses experimentos não mostraram uma regulação do gene ure1 desse fungo dependente de pH. Adicionalmente, esse trabalho descreve, pela primeira vez, experimentos de RT-PCR utilizando RNA extraído de leveduras de P. brasiliensis após 6 horas de co-cultura com macrófagos murinos. Os resultados mostram um aumento no nível de expressão dos genes icl1, mls1 e ady2, quando comparada à expressão por células crescidas em meio convencional. Essas observações indicam claramente que P. brasiliensis utiliza o ciclo do glioxalato como uma importante via metabólica alternativa para produção de energia, como observado para outros fungos. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT

The fungus Paracoccidioides brasiliensis is the ethiologic agent of paracoccidioidomycosis, the most prevalent systemic mycosis in Latin America. The most important mechanism of host defense against P. brasiliensis infection is cell-mediated immune response. This fungus is able to survive and replicate within the phagossome of murine and human macrophages, revealing that it have evolved mechanisms allowing its survival within the phagocytic cells, which are considered an inhospitable habitat. In agreement with the ability to survive in this nutritionally poor, oxidative stress and low pH environment, the analysis of P. brasiliensis transcriptome revealed several putative orthologs to virulence genes of other human facultative intracellular pathogenic microorganisms. In this context, this work describes the analysis of putative virulence genes expression by RT-PCR. In order to evaluate the expression of glyoxylate cycle genes, icl1 (isocitrate lyase) and mls1 (malate synthase), the yeast form of P. brasiliensis was grown in media mimicking the phagossome millieu, in which glucose was replaced by acetate as a sole carbon source. The results suggests a significantly increase in the icl1 and mls1 expression when this fungus was grown in media with acetate as the only carbon source. The same analyzis was performed for ady2 gene, that encode an acetate permease, and icl2 gene, that probably encodes another putative isoform of isocitrate lyase enzyme. However, the results indicate that ady2 and icl2 genes of P. brasiliensis are not regulated by these different carbon sources used in this work. On the other hand, the expression of ure1 (urease) was analyzed in this work when P. brasiliensis yeast cells were grown in acid pH, mimicking the phagossome environment. These experiments don’t show a pHdependent regulation by ure1 gene of this fungus. In addition, this work describes for the first time RT-PCR experiments using RNA extracted from yeast cells recovered from murine macrophages after 6 hours of co-culture. The results show the higher levels of icl1, mls1 and ady2 gene expression when compared to cells grown in conventional media. These observations clearly indicates that P. brasiliensis uses the glyoxylate cycle as an important alternative energetic metabolism pathway, as observed for other fungi.