Estudos moleculares dos genes XYL1 e XYL2 de Candida tropicalis visando à produção de xilitol

Abstract

O xilitol é um adoçante natural, anticariostático, utilizado principalmente na indústria de alimentos, com consumo anual estimado em 500.000 toneladas. O seu valor econômico, aliado a suas diversas aplicações, impulsionam pesquisas biotecnológicas para aumentar sua produção. A Candida guilliermondii FTI 20037 é uma das mais promissoras leveduras para produção de xilitol com rendimento acima de 0,5 g/Lh. Além disso, é capaz de produzir xilitol a partir de hidrolisado hemicelulósico de diversos resíduos agrícolas. A partir do seqüenciamento de regiões do DNA ribossômico de C. guilliermondii FTI 20037 foi demonstrado que esta levedura deve ser re-classificada como Candida tropicalis. O presente estudo representa uma das primeiras iniciativas para se desenvolver um sistema que permita a transformação genética de C. tropicalis com a finalidade de potencializar a produção de xilitol através da manipulação dos genes XYL1 (xilose redutase) e XYL2 (xilitol desidrogenase). Estes genes foram clonados e suas seqüências analisadas. O gene XYL2 por não ter sido ainda caracterizado, foi objeto de estudos mais detalhados. XYL2 é representado por uma ORF (open reading frame) de 1092 pb, que potencialmente codifica um polipeptídeo de 364 resíduos de aminoácidos, com ~40 kDa. XYL2 não possui íntrons, apresenta-se em única cópia no genoma de C. tropicalis e é controlado em nível transcricional pela presença de xilose. A seqüência primária da ORF XYL2 é idêntica à publicada no projeto genoma de C. tropicalis. Estudos de modelagem molecular demonstraram que a proteína Xyl2 pertence à família MDR (medium chain alcohol dehydrogenase) contendo sítios para ligação a zinco e NAD+. Para demonstrar sua funcionalidade, os genes XYL1 e XYL2 foram expressos com sucesso em S. cerevisiae. Visando o estabelecimento de um sistema de transformação para espécies de Candida um gene sintético (ZeoCan) que confere resistência a zeocina foi desenvolvido com o codon preferencial de C. tropicalis. Todavia, os resultados de transformação mostraram que a resistência a zeocina não é indicada como marca de seleção para C. tropicalis uma vez que esta levedura deve possuir mecanismos genéticos para anular o efeito do antibiótico. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT

Xylitol is a natural sweetener mainly used in the food industry with an annual estimated consumption of 500.000 tons. The high ecomonic value of xylitol together with its multiple applications have driven many biotechnological studies in order to improve its production. The Candida guilliermondii FTI 20037 is one of the most promising yeast of xilitol production with yields over 0.5 g/Lh. In addition, it is capable of producing xylitol from hemicellulosic hydrolysate derived from several raw materials. From the sequencing of ribossomal DNA regions from C. guilliermondii FTI 20037 we have shown that this yeast should be re-classified as Candida tropicalis. The present work represents one of the first initiatives towards the development of a system which would allow the genetic transformation of C. tropicalis with the goal of improving xylitol production through the manipulation of the genes XYL1 (xylose reductase) and XYL2 (xylitol dehydrogenase). These genes were cloned and the sequences were analyzed. Since XYL2 had not yet been characterized it was the focus of more detailed studies. XYL2 is represented by a 1092 pb open reading frame which potentially codes for a 364 residues polypeptide with ~40 kDa. XYL2 does not have introns, it is present as a single copy in the C. tropicalis genome and is controlled at the transcriptional level by the presence of xylose. The primary sequence of the XYL2 ORF is identical to the published sequence from the C. tropicalis genome project. Molecular modeling studies showed that the Xyl2 protein belongs to the MDR (medium chain alcohol dehydrogenase) family containing binding sites for zinc and NAD+. In order to functionally analyze the cloned genes, XYL1 and XYL2 were successfully expressed in S. cerevisiae. In order to establish a transformation system for Candida species a synthetic gene (ZeoCan) which confers zeocin resistance was developed with the C. tropicalis codon usage. However, the results from transformation experiments showed that the zeocin resistance gene should not be employed as selective marker in C. tropicalis since this yeast must display genetic mechanisms to counteract the effects the antibody.