Acúmulo de ricina em sementes de mamona e silenciamento do gene em plantas geneticamente modificadas

Abstract

A mamona (Ricinus communis L.) é uma oleaginosa de grande importância social e econômica. O óleo extraído de suas sementes é utilizado na produção de biodiesel e como insumo para as indústrias químicas, de cosméticos e de lubrificantes. Além do óleo extraído das sementes, sua cadeia produtiva gera subprodutos, especialmente a torta de mamona, que pode ser utilizada como adubo orgânico de boa qualidade (alta concentração de nitrogênio) ou como alimento animal (alta concentração de proteína). O principal entrave de seu uso como alimento animal é a ricina, uma proteína altamente tóxica, encontrada na semente. A ricina é uma lectina, composta por duas subunidades conhecidas como cadeias A e B. Quando ingerida a cadeia B liga-se à galactose na superfície celular, fazendo com que a proteína penetre na célula. Dentro da célula, a cadeia A, que possui atividade enzimática, inativa a subunidade 60S do ribossomo impedindo a produção de proteínas, levando a célula à morte. Os objetivos desse trabalho foram: avaliar a existência de variabilidade genética para concentração de ricina em sementes de mamona de 20 acessos do banco de germoplasma da Embrapa; estudar a distribuição e acúmulo de ricina durante o desenvolvimento da semente de mamona na cultivar BRS Energia; e realizar a transformação genética visando o silenciamento dos genes que codificam para a ricina em sementes de mamona geneticamente modificadas. Para tanto, foram utilizadas técnicas de ELISA (Enzymelinked immunosorbent assay) para a quantificação da ricina nos extratos protéicos totais das sementes, análises imunocitoquímicas, utilizando microscopia de luz e eletrônica para a localização da ricina nas células do endosperma da semente e transformação genética por biobalística visando o silenciamento dessa proteína na semente de mamona, utilizando a metodologia de RNA interferente. Os resultados obtidos mostraram a existência de variabilidade para a concentração de ricina nos acessos do banco de germoplasma da Embrapa Algodão, sendo possível a seleção de genótipos com alto e baixo teor de ricina. As cultivares comerciais IAC Guarani, BRS Nordestina e BRS Paraguaçu apresentaram as menores concentrações de ricina, sendo, as mais indicadas para trabalhos de melhoramento visando à utilização da torta como ração animal. Dentre as cultivares comerciais, a BRS Energia apresentou o valor mais elevado na concentração dessa proteína. Durante o desenvolvimento das células do endosperma da semente de mamona da cultivar BRS Energia ocorreu um aumento no número de vesículas de reserva (vacúolos de armazenamento de proteínas e corpos lipídicos) e diminuição do volume citoplasmático celular. O acúmulo de ricina na cultivar BRS Energia aumentou com o desenvolvimento da semente, sendo que na semente madura (60DAP) essa concentração foi máxima. A ricina pode ser encontrada também nos cristalóides dos vacúolos de armazenamento de proteínas (PSV) e não só na matriz, contrariando observações bioquímicas anteriores em que os componentes protéicos foram encontrados apenas compartimentalizados dentro dos corpos protéicos. Na etapa relacionada à transformação genética da mamona, em cultura de tecidos, o regulador TDZ foi mais eficiente na indução de brotações que o BAP. A adição ao meio de cultura de IBA e AgNO3 foi importante para o alongamento das brotações e enraizamento dos explantes. O uso de biorreatores visando o alongamento dos explantes foi eficiente por curtos períodos. É possível obter plantas geneticamente modificadas de mamona usando imazapir como agente seletivo. O sistema de transformação genética por biobalística apresentou eficiência similar a outros sistemas de transformação de mamona. Assim, no presente trabalho, além de estudar a variabilidade para a concentração de ricina em diferentes genótipos, foi possível identificar seu acúmulo durante o desenvolvimento da semente de mamona. Foram obtidas também plantas transgênicas, que deverão ser analisadas para confirmar a redução total ou parcial da ricina, bem como avaliar em seus descendentes a herança do silenciamento. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT

Castor bean (Ricinus communis L.) is an oilseed of great economic and social importance. The oil extracted from its seeds is used in biodiesel production and as raw material for chemicals, cosmetics and lubricants. Besides the oil extracted from the seeds, their production chain generates side-products, which can be used as organic fertilizer of good quality (high nitrogen concentration) or as animal food (with high protein content). The main obstacle to its use for animal feeding is ricin, a highly toxic protein, found in the seed. Ricin is a lectin composed of two subunits known as chains A and B. When ingested, the B chain binds to galactose on the cell surface, penetrating into the cell. Inside the cell, the A chain, which has enzymatic activity, inactivates the 60S subunit of the ribosomes preventing the production of proteins, leading to cell death. The objectives of this study was (1) to assess the existence of genetic variability for the concentration of ricin in castor bean seeds from 20 accessions of germplasm bank of Embrapa, (2) study the distribution and accumulation of ricin during seed development, and (3) perform genetic transformation aimed at silencing the genes coding for ricin in genetically modified castor bean seeds. ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) was used to quantify ricin in total protein extracts of seeds, immunocytochemical analysis using light and electron microscopy for the localization of ricin in cells of the endosperm of the seed and genetic transformation by biolistic targeting the silencing of this protein in castor seeds, using the strategy of interfering RNA (RNAi). The results showed the existence of variability for the concentration of ricin in accessions of the germplasm bank of Embrapa Algodão, it is possible to select genotypes with high and low levels of ricin. The cultivars IAC Guarani, BRS Nordestina and BRS Paraguaçu had the lowest concentrations of ricin, and are quite suitable for breeding aiming to use the seed cake to feed animals. Among the commercial cultivars, BRS Energia presented the highest concentration of this protein. During the development of cells in the endosperm of castor seeds of BRS Energia exhibited an increasing number of reserve vesicles (protein storage vacuoles and lipid bodies) and decreased cytoplasmic volume. The accumulation of ricin in the BRS Energia increased with seed development, and in the mature seed (60DAP) the concentration was the maximum. Ricin can also be found in crystalloids of protein storage vacuoles (PSV) and not only in the matrix, contrary to previous biochemical observations that the protein components were found only compartmentalized within the protein bodies. Genetic transformation of castor bean was developed, with the regulator TDZ being more effective in inducing shoots then BAP. In addition, IBA and AgNO3 were important for the elongation of shoots and rooting of explants. The use of bioreactors in order to elongate the explants was effective for short periods. It is possible to obtain genetically modified castor bean using as selective agent the imazapyr. The transformation system based on the biolistic process presented efficiency similar to other protocols.