Vacinação com a proteína de choque térmico HSP60 induz resposta imune protetora contra a infecção pulmonar induzida pelo Paracoccidioides brasiliensis e transformação em Paracoccidioides brasiliensis

Abstract

Paracoccidioides brasiliensis causa uma micose crônica granulomatosa prevalente na América Latina. O sucesso da resolução da infecção por este fungo é dependente da ativação da imunidade celular. Nós identificamos previamente a proteína de choque térmico 60 (HSP60) como um alvo da resposta humoral na paracoccidioidomicose. Neste trabalho nós expressamos o gene codificante para a proteína de choque térmico 60 em Escherichia coli e a atividade imunobiológica deste antígeno recombinante foi analisada. A imunização de camundongos BALB/c com a proteína recombinante emulsificada em adjuvante estimulou a resposta immune celular como acessado pela proliferação e produção de interferon-gama. A vacinação com a HSP60 reduziu a carga fúngica em camundongos infectados com f 106 ou 107 leveduras. As células T CD4+ foram necessárias para a eficácia da vacinação e ambas as fases: aferente e eferente. Contudo, nós demonstramos que o antígeno imunodominante é um candidato para o desenvolvimento de uma vacina contra este fungo. Na segunda parte do trabalho, leveduras de P. brasiliensis foram convertidas em resistentes a higromicina B pelo sistema de transformação mediado por Agrobacterium-tumefaciens utilizando um vetor binário plasmidial pCB301 contendo os genes da higromicina B fosfotransferase (hph) e o repórter green fluorescent protein (GFP) controlados pelo promotor CBP1 de Histoplasma capsulatum e o terminador Ura5. A transformação mediada por Agrobacteriumtumefaciens produziu transformates estáveis capazes de crescer em altas concentrações de higromicina B. A expressão de GFP foi analisada por microscopia confocal e a variação da intensidade de fluorescência sugeriu a integração do TDNA em sítios randômicos do genoma do fungo. _____________________________________________________________________________ ABSTRACT

Paracoccidioides brasiliensis causes a chronic granulomatous mycosis prevalent in Latin America. Successful resolution of infection with this fungus is dependent on activation of cellular immunity. We previously identified heat shock protein 60 as a target of the humoral response in paracoccidioidomycosis. Herein we expressed the gene encoding the heat shock protein 60 in Escherichia coli and analyzed the immunological activity of this recombinant antigen. Immunization of BALB/c mice with recombinant protein emulsified in adjuvant stimulated a cellular immune response as assessed by proliferation and interferon-gamma production. Vaccination with heat shock protein 60 reduced fungal burden in mice given 106 or 107 yeasts. CD4+ cells were necessary for the efficacy of vaccination in both the afferent and efferent phases. Thus, we have demonstrated that this immunodominant antigen is a candidate for development of a vaccine against this fungus. In a second part of this work, yeasts of P. brasiliensis were transformed to hygromycin B resistance by a Agrobacterium-tumefaciens-mediated transformation system using a binary plasmid vector pCB301 containing the hygromycin B phosphotransferase hph) and the enhanced green fluorescent protein (GFP) genes controlled by the CBP1 promoter from Histoplasma capsulatum and the Ura5 terminator. Agrobacterium-tumefaciens-mediated transformation yielded stable transformants capable of growing on increased concentrations of hygromycin B. The expression of GFP was analyzed by confocal microscopy and the intensity fluorescence variation suggested an integration of the T-DNA at random sites in the genome of the fungus.