Fecundação e clivagem após a ativação da proteína quinase c durante a maturação de oóciotos bovinos

Abstract

A formação de pró-núcleos, clivagem e perfil protéico foram avaliados após a ativação da proteína quinase C (PQC) durante a maturação de complexos cumulus-oócito (CCOs) bovinos. Visando a determinar estes efeitos da PQ-C, 1936 CCOs foram distribuídos aleatoriamente em 4 tratamentos, sendo maturados na presença de PMA (100nM phorbol 12-myristate 13-acetate, ativador da PQ-C), de 4α-PDD (100nM de 4α- phorbol 12,13-didecanoetate, forbol éster que não ativa a PQ-C; controle forbol éster), de SVE (10% de soro de vaca em estro, controle positivo) e de um controle negativo constituído pelo meio de maturação básico para os demais tratamentos, com exceção do SVE, onde não foi adicionado o álcool polivinílico (PVA). Os CCOs foram mantidos na presença de PMA por 1, 4 e 7 horas, sendo após, transferidos para o meio básico de maturação até que se completassem 24 horas de cultivo. A estimulação da PQ-C, por esses períodos, não alterou a formação de prónúcleos, porém, diminuiu a percentagem de clivagem dos zigotos. Os resultados do grupo 4α-PDD comprovam que as alterações ocorridas no grupo PMA são devido à ativação da PQ-C e não ação direta do forbol éster na célula. A análise da composição protéica demonstrou uma banda de proteína adicional no grupo SVE ao redor de 74 kilo Daltons (kDa). Os resultados desse estudo, quando associados aos dados preliminares de Western blot, indicam a importância da PQ-C na regulação da maturação, fecundação e clivagem de embriões bovinos. ________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT

In the present study the pronucleus formation, cleavage and protein profile after protein kinase C (PK-C) activation were evaluated during bovine oocyte maturation. A total number of 1936 bovine cumulus-oocyte complexes (COCs) were randomly distributed in 4 treatments, and matured with PMA (100nM phorbol 12-myristate 13-acetate, PK-C activator), 4α- PDD (100nM de 4α-phorbol 12,13-didecanoetate, phobol ester that do not bind on PK-C, phorbol ester control), ECS (10% of estrus cow serum, positive control) and in a negative control (basic maturation media for all treatments, except on ECS group where the polyvinyl alcohol was not added). The COCs were kept in presence of PMA for 1, 4 or 7 hours and then transferred to basic maturation media until the 24 hours maturation period was completed. The PK-C stimulation in these periods did not alter the pronucleus formation but caused a decrease in the zygotes cleavage rate. The 4α-PDD group results showed that the alterations in PMA group were caused by PK-C activation and not by direct phorbol ester action on the cell. The protein composition analysis showed an additional protein band on ECS group around 74 kilo Daltons (kDa). Altogether, these results with the preliminary Western Blot analysis, indicate an important role of PK-C on bovine oocyte maturation, fertilization and embryo cleavage.