Investigação das concentrações plasmáticas e pulmonares da Anfotericina B (AMB) estruturada em polímero biodegradável de Ácido Polilático-Poliglicólico (PLGA) revestido com Ácido Dimercaptossuccínico (DMSA)

Abstract

O presente trabalho avaliou a utilização e validou um método de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) para quantificar o antifúngico anfotericina B (AMB) em amostras de plasma e pulmão de camundongos. Este método foi utilizado para quantificar os níveis de AMB em amostras teciduais obtidas de animais tratados com um possível sistema deliberação sustentada de AMB, Nano-D-AMB (NanoAnf), baseado em misturas de polímeros de ácido polilático-co-glicólico (PLGA) e ácido dimercaptossuccínico(DMSA). O protocolo experimental incluiu a extração em fase sólida da AMB, seguido por uma análise por CLAE com detecção UV a 382 nm. Para a separação cromatográfica, utilizou-se uma coluna C18 defase reversa e uma fase móvel composta por acetonitrila:EDTA 10 mM (40:60, v/v) em pH4,65. Foi observada resposta linear no intervalo de concentração de 2,25-180 μg . mL-1, com limite de quantificação de 0,68 μg . mL-1. Os desvios padrões relativos dos ensaios intra-dia e inter-dia foram inferiores a 6% (n = 15). As taxas de recuperação das extrações variaram de acordo com os tecidos avaliados e com as concentrações utilizadas na fortificação dos mesmos (0,5-5 μg . mL-1), obtendo-se valores médios de 74,6% e 61,3% para plasma e pulmões, respectivamente. Os testes de concentração plasmática e pulmonar de AMB foram realizados em camundongos, divididos em 6 grupos de 5 animais, como segue: grupo I(tratado com Nano-D-AMB (NanoAnf), 6 mg . kg-1 i.p., eutanásia em 24 h); grupo II (tratado com Nano-D-AMB (NanoAnf), 6 mg . kg-1 i.p., eutanásia em 48 h); grupo III (tratado com Nano-D-AMB (NanoAnf), 6 mg . kg-1 i.p., eutanásia em 72 h); grupo IV (tratado com Anforicin B®, 6 mg . kg-1 i.p., eutanásia em 24 h); grupo V (tratado com Anforicin B®, 6 mg .kg-1 i.p., eutanásia em 48 h); grupo VI (tratado com Anforicin B®, 6 mg . kg-1 i.p., eutanásia em 72 h). As concentrações plasmáticas de AMB nos tempos 24 h, 48 h, e 72 h foram superiores nos grupos tratados com Nano-D-AMB (NanoAnf) (2,04 ± 0,51; 2,31 ± 0,57; 1,85± 0,46, respectivamente) em relação àqueles tratados com Anforicin B® (1,16 ± 0,19; 1,41 ±0,56; 1,32 ± 0,41, respectivamente) (p<0,05, Mann-Whitney test). Quanto aos níveis pulmonares, não foi verificada diferença significativa entre os tratamentos. Para ambas aspreparações, verificou-se um pico de concentração tecidual de AMB após 48 h de tratamento,apesar da diferença não apresentar significância estatística. Concluindo, o presente estudo avaliou um protocolo de CLAE exato e preciso para determinação de AMB no plasma e pulmões de camundongos. A preparação nano estruturada de AMB, Nano-D-AMB(NanoAnf), apresentou níveis plasmáticos superiores ao longo do tempo, o que pode sugerir um fenômeno de liberação sustentada do fármaco a partir das estruturas poliméricas de PLGA e DMSA. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT

The present work was aimed to validate a High Performance Liquid Chromatography(HPLC) method for measuring amphotericin B (AMB) concentrations in murine plasma andlung samples. This method was used to quantify the levels of AMB in tissue samples obtained from animals treated with a desoxycholate amphotericin sustained delivery system based on poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) and dimercaptosuccinic acid (DMSA)polymeric blends (Nano-D-AMB). The experimental protocol includes the solid-phase extraction of AMB followed by HPLC analysis with UV detection at 382 nm. Forchromatographic separation, we used a C18 reversed-phase column and a mobile phase composed by acetonitrile:EDTA 10 mM (40:60, v/v) at pH 4.65. A linear response was observed in the concentration range of 2.25-180 μg . mL-1, with a limit of quantification of0.68 μg . mL-1. The intra-day and inter-day relative standard deviations (R.S.D.) were lessthan 6% (n=15). The extraction recovery rates varied according to the tissue and the spiked concentrations used (0.5-5 μg . mL-1); the recovery rates were 74.6% and 61.3% for plasma and lungs, respectively. For testing the AMB levels in lungs and plasma of treated mice, the animals were randomly divided into six groups of 5 animals as follows: group I (treated withNano-D-AMB 6 mg . kg-1 i.p., euthanized at 24 h); group II (treated with Nano-D-AMB, 6mg . kg-1 i.p., euthanized at 48 h); group III (treated with Nano-D-AMB, 6 mg . kg-1 i.p.,euthanized at 72 h); group IV (treated with Anforicin B®, 6 mg . kg-1 i.p., euthanized at 24 h);group V (treated with Anforicin B®, 6 mg . kg-1 i.p., euthanized at 48 h); group VI (treatedwith Anforicin B®, 6 mg . kg-1 i.p., euthanized at 72 h). Nano-D-AMB provided higher AMBconcentrations in plasma at 24 h, 48 h, and 72 h (2.04 ± 0.51; 2.31 ± 0.57; 1.85 ± 0.46,respectively) than Anforicin B® (1.16 ± 0.19; 1.41 ± 0.56; 1.32 ± 0.41) (p<0.05, Mann-Whitney test). However, no significant differences were found in the pulmonary levels for allperiod of time tested. Although the level of AMB has showed a peak at 48 h after treatment,no significant differences were found along of the time intervals for both tested preparations.In conclusion, this study evaluated a HPLC protocol that provided an accurate and precise method to measure AMB concentrations in murine plasma and lung samples. Thenano structured preparation of AMB named Nano-D-AMB showed a marked increase inplasma concentration over the time, which could reflect a sustained drug releasing behaviorfrom the PLGA and DMSA polymeric blends.