Caracterização genética e molecular de acessos de bananeira a Radopholus similis e Meloidogyne incognita

Abstract

A cultura da bananeira tem grande importância econômica e social em todo o mundo. O Brasil é o quarto produtor mundial de banana, sendo esta cultivada de Norte a Sul do País e, praticamente toda produção é comercializada no mercado interno. Problemas fitossanitários de variadas etiologias reduzem a vida útil dos plantios e levam a perdas na produção e na qualidade dos frutos. Dentre os fitonematoides, Radopholus similis, Meloidogyne incognita, M. javanica, M. arenaria, Helicotylenchus multicinctus, Rotylenchulus reniformis e Pratylenchus coffeae são considerados os de maior importância para a bananicultura. O parasitismo dos nematoides além de levar a perdas diretas, pode acarretar perdas indiretas, como gastos com fertilizantes, outros insumos e mão de obra para evitar maiores perdas de produção. Também o uso de nematicidas pode acarretar em risco de intoxicação durante a aplicação e de contaminação do meio ambiente. Tendo em vista que o princípio da resistência de plantas a doenças constitui uma das medidas de controle mais compatíveis com a sustentabilidade agrícola, estabelecemos como objetivo deste projeto buscar uma forma de viabilizar o controle de nematoides por meio de resistência e tolerância varietal na cultura da banana, estudando a variabilidade do patógeno e do hospedeiro, além de iniciar o estudo da interação nematoide vs. Musa utilizando técnicas moleculares. O uso de métodos de multiplicação em massa de fitonematoides in vitro em condições axênicas permite intensificar os estudos de taxonomia, biologia, epidemiologia e controle desses patógenos. Portanto, devido a necessidade de multiplicação massal de R. similis para a produção de inóculo com a finalidade de atender aos experimentos, tentou-se otimizar o método de multiplicação do inóculo para o nematoide, já que há variação da eficiência entre diferentes métodos de multiplicação. Foram avaliadas duas metodologias de multiplicação in vitro para R. similis e Pratylenchus brachyurus em três períodos de avaliação (20, 40 e 60 dias). Ambas as metodologias utilizam cilindros de cenoura em frascos com tampas, sendo que em uma delas foi adicionado meio agar-água no interior dos frascos. O método com agar-água mostrou-se mais efetivo que o método sem agar-água, para ambas as espécies, com um aumento populacional em torno de 280 vezes para R. similis e 226 vezes para P. brachyurus, enquanto o outro método aumentou 5 e 2 vezes, respectivamente, após 60 dias. O grau de resistência de oito acessos de bananeiras a diferentes populações de R. similis foi verificado e a diferença de agressividade entre as populações do nematoide também foram avaliadas. Plantas dos acessos 4249-05, 4279-06, Yangambi Km5, 0323-03, 0337-02, 1304-06, Borneo e Grande Naine foram inoculadas com 400 nematoides por planta e mantidas em casa de vegetação por 60 dias. Cada acesso foi inoculado com três populações de R. similis provenientes de Pernambuco, Distrito Federal e Santa Catarina, separadamente, com 5 repetições. Os acessos 4249-05, Yangambi Km5, 0323-03 e 4279-06 apresentaram níveis diferentes de resistência ao nematoide cavernícola com base na percentagem de redução do fator de reprodução. A população de PE foi considerada a mais agressiva em relação às demais, enquanto que a do DF foi mais agressiva que a de SC. Foi avaliada também a reação de clones diploides e triploides de bananeira em relação aos nematoides R. similis (nematoide cavernícola) e M. incognita (nematoide das galhas), em condições de campo com base nas taxas de multiplicação de cada nematoide e no desenvolvimento das plantas. As plantas foram previamente inoculadas com 200 juvenis, machos e fêmeas de R. similis, ou 2500 ovos e juvenis de M. incognita em vasos distintos. Os acessos foram avaliados após 13 meses da inoculação, em condições de campo. Os acessos 1304-04, 4223-06, 1318-01, 1319-01, Tjau Lagada e N118 se mostraram tolerantes ao nematoide cavernícola e os acessos N118, Pipit e Birmanie tolerantes ao nematoide das galhas, sendo que estes acessos permitiram a multiplicação do nematoide e não tiveram o desenvolvimento afetado. Para o entendimento de componentes da resistência horizontal-vertical e da agressividade-virulência do patossistema Musa spp. vs. R. similis, foram utilizadas as populações de Santa Catarina (SC), Distrito Federal (DF) e Pernambuco (PE) do nematoide, além dos acessos 4249-05, Yangambi Km5, 0323-03, 4279-06, Grande Naine, 0337-02, Borneo e 1310-06. De cada população de R. similis foram inoculados 400 nematoides por planta em casa de vegetaçao. Os nematoides foram extraídos das raízes e do solo 60 dias após a inoculação. O fator de reprodução (FR) para cada acesso em relação a cada população de nematoide foi determinado. Na análise dos dados utilizou-se o modelo IV de Griffing (1956), no esquema de dialelo parcial, com quatro repetições. Os acessos com maior resistência horizontal foram 4249-05 e Yangambi Km5 e a população mais agressiva do patógeno foi a de Pernambuco. Marcadores moleculares SSR e RAPD foram utilizados para a análise molecular de 11 acessos de Musa contrastantes para os fenótipos de resistência aos nematoides R.similis, M. incognita, M. javanica e M. arenaria, visando identificar primers e selecionar marcadores moleculares promissores para futuros trabalhos de mapeamento genético da resistência, além de estudar a diversidade genética dos acessos. Os acessos Birmanie, Pisang Nangka, Borneo, Grande Naine, Yangambi Km5, 1304-06, 4279-06, 4223-06, 8694-15, 1304-04 e 4249-05 foram selecionados conforme a percentagem de redução do fator de reprodução de cada espécie de nematoide de acordo com Santos (2007) e Teixeira (2007). O DNA genômico dos onze acessos foi extraído, sendo utilizados 13 primers RAPD e 14 pares de primers microssatélites. Um total de 195 marcadores RAPD e 59 alelos microssatélites foram gerados. Do total de marcadores, 183 RAPD e 56 SSR foram polimórficos e, 44 e 17, respectivamente, mostraram-se promissores para trabalhos futuros de mapeamento genético para resistência a M. incognita, M. javanica, M. arenaria e R. similis. Entre todos os primers utilizados, 92 % para RAPD e 78 % para SSR geraram ao menos uma banda ou alelo promissor para estudos de mapeamento genético. Os primers decâmeros para RAPD OPE-09, OPG-12 e OPG-05 e, os pares de primers SSR AGMI25/AGMI26 e AGMI101/AGMI102 apresentaram o maior número de alelos promissores e se destacaram para futuros trabalhos de mapeamento genético. As distâncias genéticas entre os diferentes acessos baseadas nos marcadores RAPD variaram de 0,29 a 0,62 e, com base nos microssatélites variaram de 0,33 a 0,78. Os acessos Pisang Nangka e Grande Naine apresentaram a menor distância genética com base nos marcadores RAPD e os acessos Yangambi Km5 e 4223-06 com base nos marcadores SSR. Os acessos contrastantes para a resistência, 4279-06 e Borneo apresentaram, respectivamente distância genética de 0,48 e 0,60 e um total de 37 marcadores RAPD e 10 alelos SSR polimórficos e promissores para o mapeamento genético. Para os acessos contrastantes 4279-06 e 1304-04, as distâncias genéticas foram, respectivamente, de 0,47 e 0,46 e o total de bandas polimórficas promissoras para o mapeamento foi de 36 e 9 para os marcadores RAPD e microssatélites. Para analisar a expressão de genes análogos de resistência (RGAs) em acessos resistente (Yangambi Km5) e suscetível (Grande Naine) ao nematoide R. similis, na presença e ausência do patógeno em momentos diferentes após a inoculação, um bioensaio foi realizado com duração de 7 dias em casa de vegetação. As raízes foram coletadas em quatro períodos distintos, 0, 3, 5 e 7 dias após inoculação. Doze pares de primers desenhados a partir de sequências de RGAs da família NBS-LRR (sítio de ligação a nucleotídeos e região de repetição rica em leucina) foram utilizados para a análise de expressão diferencial via RT-PCR a partir do RNA extraído das raízes. Seis protocolos de extração de RNA foram testados. O protocolo do Concert Plant RNA Reagent foi selecionado, pois possibilitou a extração de RNA em quantidade e qualidade ideais. Os genes RGC5 e RGA14 não foram expressos em nenhum dos dois acessos. Os genes RGA10, Franc_MbPKW_RGA08L, Franc_MbPKW_RGA08O, se revelaram como constitutivos e expressos em todos os tempos para ambos os acessos. Outros genes que apresentaram uma expressão basal foram os RGA37, RGA41, RGC3 e RGC1, sendo que o primeiro foi expresso de forma constitutiva apenas para Yangambi Km5, os dois seguintes apenas para Grande Naine, e o últimos para ambos os acessos. O gene Franc_MbPKW_RGA08E teve um aumento na concentração a partir do tempo 3 para o acesso resistente, sendo que para a planta suscetível este gene só foi começar a ser expresso no tempo 7. O gene RGC2 foi expresso apenas no acesso resistente no tempo 5. O gene Franc_MbPKW_RGA08K foi expresso tardiamente em Grande Naine e para Yangambi Km5 foi constitutivo, mas deixou de ser expresso a partir do período de tempo 3. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT

Banana plantations have great economic and social importance worldwide. Brazil is the fourth largest producer of bananas, which is planted from North to South, and almost total fruit produced is sold domestically. Phytosanitary problems of varied etiologies reduce crop life span and lead to yield losses and poor fruit quality. Among the plant-parasitic nematodes, Radopholus similis, Meloidogyne incognita, M. javanica, M. arenaria, Helicotylenchus multicinctus, Pratylenchus coffeae and Rotylenchulus reniformis are considered the most important for banana production. Parasitism by nematodes also lead todirect and indirect losses, such as spending on fertilizers, and other inputs and labors to mitigate crop losses. Furthermore, the use of nematicides can carry risks of intoxication during application, and environmental contamination. Considering that the principle of plant resistance to diseases is one of the most consistent strategy with sustainable farming, the goal for this project is to achieve control of nematodes in banana through varietal resistance or tolerance. For that, we analyzed the variability of the pathogen and host, and studied the interaction Musa vs. nematode at molecular level. The use of mass multiplication methods of plant-parasitic nematodes in vitro allows to intensify studies on taxonomy, biology, epidemiology and control of these pathogens. Due to the need of mass production of nematodes for supplying inoculum for the experiments in this project, we optimized the method of multiplication of R. similis, since the efficiency of the methods of multiplication varies widely. Therefore, two methods for in vitro multiplication of R. similis and Pratylenchus brachyurus were evaluated in three time periods (20, 40 and 60 days). Both methods used carrot cylinders in closed lid jars. In one of them, it water-agar was added covering the bottom of the jars, whilst in the second method no water-agar was added. For both species the method with water-agar proved to be more the most efficient, with a population increase of 280 times for R. similis and 226 times for P. brachyurus, whilst by the other method, the nematode populations increased 5 and 2 times, respectively, after 60 days. ix The degree of resistance of eight accessions of banana to three different populations of R.similis has been verified, and the difference in aggressiveness between populations of the nematode has also been evaluated. Plants of accessions 4249-05, 4279-06, Yangambi Km5, 0323-03, 0337-02, 1304-06, Borneo and Grande Naine were inoculated with 400 nematodes per plant and maintained under greenhouse for 60 days. Each access was inoculated with three populations of R.similis from Pernambuco (PE), Federal District (DF) and Santa Catarina (SC), separately, with five replicates. Accessions 4249-05, Yangambi Km5, 0323-03 and 4279-06 expressed different levels of resistance to the burrowing nematode. The population from PE was considered the most aggressive. The population from DF was more aggressive whe compared to the one from SC. The reaction of clones of diploid and triploid bananas was evaluated to the burrowing nematode (R. similis), and to the root-knot nematode (Meloidogyne incognita), under field conditions, based on the multiplication rates of each nematode and plant development. Plants were inoculated with 200 juveniles, males and females of R.similis, or 2500 eggs and juveniles of M. incognita in pots, separately. The accessions were evaluated 13 months after inoculation under field conditions. Accessions 1304-04,4223-06, 1318-01, 1319-01, Tjau Lagada and N118 reacted as tolerant to the burrowing nematode, while N118, Birmanie, Pipit as tolerant to the root-knot nematode. To understand the components of horizontal-vertical resistance and of virulence-aggressiveness in the pathosystem Musa spp. vs. R. similis were used, three populations of R. similis, from Santa Catarina (SC), Federal Distrito (DF), Pernambuco (PE), and eight accessions of banana (4249-05, Yangambi KM5, 0323-03, 4279-06, Grande Naine, 0337-02, Borneo, and 1310-06). Each accession was inoculated with 400 nematodes per plant under greenhouse. The nematodes were extracted from roots and soil 60 days after inoculation. The reproduction factor (RF) for each accession and each nematode population was determined. The model IV of Griffing (1956) was adopted for analyzing the data, in partial diallel scheme with four replications. The accessions with higher horizontal resistance were 4249-05 and Yangambi Km5, and PE was the most aggressive population of the pathogen. Evidence of vertical and horizontal resistance were observed. RAPD and SSR markers were used for molecular characterization of 11 genotypes of Musa with contrasting phenotypes of resistance to the nematodes R. similis, M. incognita, M. javanica and M. arenaria, aiming to select primers and molecular markers for future work on genetic mapping of the resistance. In addition the genetic diversity of the banana genotypes was studied. These accessions were selected from a working x collection of 26 accessions of banana, based on the evaluation of the reproduction factor for each nematode species. Genomic DNA was extracted from the selected acessions, and used 13 RAPD primers and 14 pairs of microsatellite primers for obtaining molecular markers. A total of 195 RAPD markers and 59 microsatellite alleles were generated. Of the total markers, 183 RAPD and 56 SSR were polymorphic, and 44 and 17, respectively, have shown to be promising for future studies of genetic mapping for resistance to M. incognita, M. javanica, M. arenaria and R. similis. Among all primers used, 92% RAPD, and 78% SSR primers generated at least one band or allele promising for genetic mapping. Decamer primers for RAPD, OPE-09, OPG-12 and OPG-05 and the pairs of SSR primers AGMI25/AGMI26 and AGMI101/AGMI102 showed the highest number of alleles promising for future works of genetic mapping. The genetic distances between the different accessions based on RAPD markers ranged from 0.29 to 0.62 and, based on microsatellites ranged from 0.33 to 0.78. Accessions Grande Naine and Pisang Nangka showed the smallest genetic distance based on RAPD markers, and accessions Yangambi Km5 and 4223-06 the smallest distance based on SSR markers. For the contrasting accessions for resistance, Borneo and 4279-06 the genetic distances were respectively 0.48 and 60 and, with a total of 37 RAPD and 10 SSR polymorphic alleles promising for genetic mapping. For the contrasting accessions 4279-06 and 1304-04, genetic distances were, respectively, 0.47 and 0.46, and the total number of polymorphic bands promising for genetic mapping was 36 and 9 for the RAPD and microsatellites. To analyze the expression of RGAs in banana accenssions, resistant (Yangambi Km5) and susceptible (Grande Naine) to the nematode R. similis in the presence and absence of the pathogen, were used at different time periods after inoculation. A bioassay was conducted for 7 days in a greenhouse. Roots were collected in four distinct periods, 0, 3, 5 and 7 days after inoculation. Twelve pairs of primers designed from sequences of RGAs from the NBS-LRR family were used for analysis of differential expression by RT-PCR from RNA extracted from roots. Six RNA extraction protocols were tested. The protocol Concert™ Plant RNA Reagent was selected since it allowed the extraction of RNA in ideal quantity and quality. The genes RGC5 and RGA14 were not expressed in any of the two accessions. The genes RGA10, Franc_MbPKW_RGA08L, Franc_MbPKW_RGA08O, were revealed as constitutive and expressed in all times for both accessions. Other genes that showed a basal expression were RGA37, RGA41, RGC3 and RGC1. The first one was expressed constitutively only in Yangambi Km5, the next two only in Grande Naine, and the last one was expressed in both accessions. The gene xi Franc_MbPKW_RGA08E had an increased concentration starting from time 3 in the resistant accession, while in the susceptible one, this gene was only beginning to be expressed at time 7. The gene RGC2 was expressed only in the resistant accession, beginning at time 5. The gene Franc_MbPKW_RGA08K was expressed late in Grande Naine, and it proved to be constitutive in Yangambi Km5, but it stopped to be expressed at time 3.