Avaliação do efeito da miltefosina sobre a viabilidade e as funções de macrófagos peritoneais de camundongos C57BL/6

Abstract

As leishmanioses têm gerado impacto na saúde pública e fazem parte do grupo de doenças negligenciadas segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS). O tratamento constitui um desafio de alta complexidade por se tratar de uma doença de difícil controle e cujos medicamentos disponíveis são injetáveis, têm alta toxicidade e são passíveis de falha terapêutica. A miltefosina (hexadecilfosfocolina) oral tem se mostrado eficaz e segura no tratamento da leishmaniose cutânea, mucocutânea e visceral, no entanto, pouco se sabe sobre seu mecanismo de ação e seus efeitos sobre os macrófagos, células parasitadas pelas leishmânias. Este estudo teve como objetivo avaliar, in vitro, o efeito da miltefosina sobre a viabilidade dos macrófagos, além de testar a influência da droga sobre a capacidade fagocitária e sobre a produção de espécies oxidativas por macrófagos peritoneais dos camundongos da linhagem C57BL/6. Para os testes de viabilidade celular, utilizou-se o método do MTT (3-(4,5-dimetil-2-tiazol)-2,5-difenil-2-H brometo de tetrazolium) e partiu-se das concentrações de 1200 e 1600μg/mL da miltefosina e as demais foram obtidas por diluição seriada. Para os demais testes foram empregadas as doses: 10, 50 e 100μg/mL de miltefosina. A capacidade fagocitária foi avaliada utilizando-se 4 x 106 Saccharomyces cerevisiae, sensibilizadas ou não com o soro dos camundongos. A produção de óxido nítrico foi determinada pela reação de Griess e o peróxido de hidrogênio determinado pelo teste de oxidação do vermelho de fenol na presença de peroxidase. Os resultados indicaram um aumento na atividade mitocondrial, portanto as células permaneceram viáveis na presença de diferentes doses de miltefosina. Isso foi demonstrado pelo progressivo aumento no percentual de redução do MTT (p<0,05, teste t pareado). A droga aumentou em 53% a fagocitose na presença de S. cerevisiae não sensibilizadas nas preparações incubadas com 50μg/mL de miltefosina (p<0,001, teste de Wilcoxon), devido ao aumento no percentual de macrófagos envolvidos na fagocitose, embora tenha diminuído a média de leveduras fagocitadas. Na presença de S. cerevisiae sensibilizadas houve aumento do índice fagocitário com 10μg/mL, alterando a mediana de 202,0 para 382,5; e com 50μg/mL da droga, alterando a mediana de 202,0 para 602,0 (p<0,001, teste de Wilcoxon), pois aumentou o percentual de macrófagos envolvidos na fagocitose e a média de S. cerevisiae ingeridas pelos macrófagos. Todas as concentrações de miltefosina testadas diminuiram, pelo menos 93%, a produção de óxido nítrico pelos macrófagos em relação à produção basal (33,1 ± 15,0) ou estimulada com lipopolissacarídeo (50,2 ± 17,4) (p<0,001, teste t pareado); porém, não afetou a produção de peróxido de hidrogênio (p>0,05, teste t pareado). Portanto, este estudo mostrou que a miltefosina foi capaz de influenciar importantes funções do sistema imune inato dos macrófagos, principalmente potencializando a fagocitose. Além disso, a inibição da produção de óxido nítrico e a não alteração da produção de peróxido de hidrogênio sugerem que a ação microbicida da droga ocorre independente da produção destes radicais, por ação direta da miltefosina sobre o parasito. Isso pode trazer importantes implicações para o emprego deste medicamento na prática clínica, podendo trazer bons resultados aos indivíduos imunodeprimidos; além de também favorecer a redução dos efeitos deletérios gerados pelo excesso de radicais e, consequentemente, diminuir a imunopatogênese da leishmaniose. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT

The leishmaniasis have generated impact on public health and are part of the group of neglected diseases according to World Health Organization (WHO). Treatment is a highly complexity challenge because it is a difficult disease to control and whose medications available are injectable, have high toxicity and are susceptible of therapeutic failure. The oral miltefosine (hexadecylphosphocholine) is an effective and safe treatment of cutaneous leishmaniasis, mucocutaneous and visceral; however, little is known about its mechanism of action and its effects on macrophages, cells infected by leishmania. This study aimed at evaluating, in vitro, the effect of miltefosine on the viability of macrophages, and at testing the influence of drug on the phagocytic capacity and the production of oxidative species by peritoneal macrophages of mice C57BL/6. For the tests of cell viability, the MTT (3-(4,5-dimetil-2-tiazol)-2,5-difenil-2-H brometo de tetrazolium) metod was used and started from the concentrations of 1200 and 1600μg/mL of miltefosine and the others were obtained by serial dilution. For all other tests doses of 10, 50 and 100μg/mL de miltefosine were used. The phagocytic capacity was assessed using 4 x 106 Saccharomyces cerevisiae, sensitized or not with the serum of mice. Nitric oxide production was determined by Griess reaction and the hydrogen peroxide production was determined by the phenol red oxidation in the presence of peroxidase. The results indicated a progressive increase in mitochondrial activity and therefore the cells remained viable in the presence of different doses of miltefosine. This was demonstrated by the progressive increase in the percentage of MTT reduction (p<0,05, paired t test). The drug increased phagocytosis by 53% using nonsensitized S. cerevisiae in preparations incubated with 50μg/mL of miltefosine (p<0,001, Wilcoxon test) due to the increased percentage of macrophages involved in phagocytosis, although the average number of phagocytosed yeasts has decreased. In the presence of sensitized S. cerevisiae, the phagocytic index increase with 10μg/mL by changing the median of 202,0 to 382,5; and with 50μg/mL, changing the median of 202,0 to 602,0 (p<0,001, Wilcoxon test), because the percentage of macrophages involved in phagocytosis and the average number S. cerevisiae ingested by macrophages was increased. All concentrations of miltefosine tested decreased at least 93%, nitric oxide production by macrophages in relation to the basal production (33,1 ± 15,0) or stimulated with lipopolysaccharide (50,2 ± 17,4) (p<0,001, paired t test); however, it did not affect the hydrogen peroxide production (p>0,05, paired t test). Therefore, this study showed that miltefosine was able to influence important functions of the innate immune system of macrophages, especially enhancing phagocytosis. Furthermore, the inhibition of nitric oxide production and the no change in the hydrogen peroxide production suggests that the antimicrobial action of the drug happens independently of production of these radicals, by direct action of miltefosine against the parasite. This can bring important implications for the use of this drug in clinical practice, and it can generate good results to the immunosuppressed individuals, in addition to also promote the reduction of harmful effects caused by excess of radicals and, consequently, reduce the immunopathogenesis of the leishmaniasis.