Metabólitos de origem fúngica : aplicações potenciais em processos biotecnológicos

Abstract

A biotecnologia visa atender inúmeros problemas que afetam a humanidade e para isto muitas moléculas devem ser exploradas como ferramentas para construir soluções alternativas. Metabólitos como os produzidos por fungos apresentam geralmente duplicidade de ação, o que permite explorar seu potencial uso em aplicações industriais em diferentes áreas, como farmacologia, agroindústria, bioprocessos, tecnologia ambiental e bioconversão. Com o objetivo de estabelecer o potencial dos metabólitos produzidos pelo fungo Beauveria bassiana, toxinas puras (beauvericina, basianina, tenellina, oosporeina) e extratos brutos foram testados em diferentes ensaios de atividade citotóxica e antimicrobiana. Os resultados mostram que a produção de beauvericina (BEA) foi significativamente diferente entre todos os isolados e sugerem uma ativa participação desses metabólitos na morte do inseto, mostrando diferenças estatisticamente significativas entre a CC50 de BEA sobre a linhagem celular Spodoptera frugiperda SF-9 (2,81 e 6,94 μM) e os valores das outras micotoxinas (4,23 - 11,95 μM). Adicionalmente, demonstrou-se o efeito no desenvolvimento da ferrugem e redução na germinação. Todos os tratamentos dos metabólitos puros e dos extratos brutos provenientes do crescimento do fungo B. bassiana apresentaram efeitos inibitórios sobre as diferentes espécies de bactérias utilizadas nos ensaios mostrando atividade bactericida contra o gênero Proteus sp. e bacteriostática sobre os gêneros Staphylococcus sp., Klebsiella sp., Salmonella sp .e E. coli. Da mesma forma, as enzimas digestivas β-glicosidases e Leucina-aminopeptidase (LAP) da broca gigante da cana-de-açúcar Telchin licus licus foram estudadas visando o controle da praga. Os resultados mostraram que as β–glicosidases da broca possuem uma Km e Vmax para p-nitrofenil-β-D-glicopiranosídeo (pNβG) de 1,74 mM e 0,005 mmol/min/mg de proteína respectivamente, a melhor atividade da enzima foi encontrada com pH 6,0 e 7,0 e temperatura entre 50 e 55° C. Do mesmo modo, demonstrou-se o efeito de diferentes inibidores e ativadores da enzima, registrando para Mg2+ o maior incremento em atividade. Na comparação da atividade especifica de LAPs com outros insetos, Hypothenemus hampei mostrou a maior atividade. T. licus licus possui 3 isoformas da enzima que são inibidas completamente com bestatin 0,1 mM a pH 7,0. Adicionalmente, um completo estudo da atividade holocelulase do fungo Schizophyllum commune demonstrou o efeito indutor do carboximetilcelulose (CMC) 1% e das diferentes fontes de carbono na produção das enzimas, aparentes Km e Vmax para pNβG das β–glicosidases de 0,303 mM e 0,504 mmol/min/mg de proteína, a melhor atividade da enzima foi a temperatura entre 50 - 60˚ C e pH 7,0. Finalmente, usando microscopia eletrônica de varredura (MEV) o mecanismo físico usado pelo fungo para degradar bambu (Guadua angustifolia) foi observado e o potencial dos metabólitos produzidos avaliado. Os dados aqui apresentados constituem uma valiosa ajuda no desenho de estratégias voltadas a geração de plantas resistentes aos insetos-praga estudados, na busca de novos compostos antibacterianos e no aproveitamento de resíduos lignocelulósicos para produção de álcool de segunda geração. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT

Biotechnology aims to address several problems affecting mankind. For this reason, many molecules should be explored as tool to develop new alternatives solutions. Metabolites produced by fungi have usually double action, which allow approach theirs potentials use in different industrial applications in areas such as pharmacology, agroindustry, bioprocess, environmental technology and bioconversion. In order to establish the potential of metabolites from Beauveria bassiana fungus, the cytotoxicity and antimicrobial activity of pures toxins (beauvericin, bassianin, tenellin, oosporein) and crude extracts were tested. The results show that beauvericin (BEA) production was significantly different among all isolates and suggest an active participation of these metabolites in the insect’s death. Statistical difference was found when BEA CC50 values on cell line Spodoptera frugiperda SF-9 (2.81 and 6.94 μM) were compared with those values from others mycotoxins (4.23 - 11.95 μM). Additionally, it was shown an effect on the development of rust, and reduced germination. All treatments of pure metabolites and crude extracts from B. bassiana growth showed inhibitory effects on different species of bacteria used in bioassays, showing bactericidal activity on the genus Proteus sp. and bacteriostatic effect on the genus Staphylococcus sp., Klebsiella sp., Salmonella sp. and E. coli. Likewise, digestive enzymes β-glucosidases and Leucine aminopeptidase (LAP) from sugarcane giant borer Telchin licus licus were studied in order to control the insect pest. The results showed apparent Km and Vmax towards p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside of 1.74 mM and 0.005 mmol/min/mg of protein respectively for β-glucosidases, the highest enzyme activity resulted with pH between 6.0 and 7.0 and temperature between 50 e 55 °C. Besides, it was shown an effect of activators and inhibitors on the enzyme with major increments with Mg2+. The LAP specific activity was compared among different insects and Hypothenemus hampei exhibited the highest activity. T. licus licus has three isoforms that are inhibited completely with 0.1 mM bestatin at pH 7.0. Finally, a complete study of holocellulase activity from Schizophyllum commune fungus showed inducing effect of 1% carboxymethyl-cellulose CMC and different carbon sources on enzyme production. Km and Vmax towards p-nitrophenyl-β-D- glucopyranoside (pNβG) of β-glucosidases were 0.303 mM and 0.504 mmol / min / mg protein respectively, the highest enzyme activity resulted with temperature between 50 - 60˚ C and pH 7.0. Finally, by using scanning electron microscopy (SEM), the physical mechanism used by the fungus to degrade bamboo (Guadua angustifolia) was observed and the potential of metabolites produced was evaluated. The data presented here constitute a valuable contribution in the design of strategies to generate plants resistant to insect pests, in search of new antibacterial compounds and the use of lignocellulosic residues for production of second generation biofuels.