Expressão recombinante e caracterização molecular e funcional da pró-insulina humana, do hormônio de crescimento humano e do fator IX de coagulação sangüínea em plantas transgênicas de soja [Glycine max L. (Merril)]

Abstract

As plantas superiores apresentam diversas vantagens para a produção de biomoléculas recombinantes quando comparadas com os demais sistemas de expressão heteróloga, incluindo baixo risco de contaminação com oncogenes, príons, vírus e outros patógenos humanos, além de alta capacidade de escalonamento, baixos custos de produção e sistemas de cultivo e produção agronômica em larga escala. Plantas transgênicas também permitem a exploração de diversos órgãos vegetais com alto conteúdo protéico, tais como sementes e tubérculos, para a expressão de diferentes proteínas recombinantes. Dentre os vegetais comumente cultivados, as plantas de soja são excelentes acumuladoras naturais de proteínas e se constituem em uma fonte de biomassa abundante e barata. Sob condições controladas de cultivo em casa de vegetação, o ciclo agronômico de plantas de soja pode ser manipulado para maximizar a produção de sementes em larga escala em áreas relativamente pequenas. No presente trabalho foram obtidas diferentes linhagens transgênicas de soja contendo os genes da pró-insulina humana, do hormônio do crescimento humano e do fator IX de coagulação sangüínea, sob o controle de seqüências regulatórias específicas para o direcionamento do acúmulo para os vacúolos das sementes. As linhagens obtidas foram caracterizadas do ponto de vista molecular e a expressão recombinante foi caracterizada nos níveis transcricional e traducional. Sementes contendo o hGH e o FIX apresentaram níveis de acúmulo da ordem de 2,9 e 0,23% PST respectivamente, o que reflete um potencial de produção de até 9 e 0,8 g de proteína recombinante por Kg de sementes. O seqüenciamento N-terminal de frações das duas proteínas por nanoLC-MSE demonstrou que os peptídeos trípticos de ambas apresentaram as seqüências de aminoácidos e as massas moleculares esperadas. Ensaios de função biológica com o hGH e o FIX demonstraram diferentes níveis de atividade detectável e que o acúmulo dessas proteínas nos PSVs, mesmo por um período de tempo prolongado (até sete anos), é uma alternativa interessante para garantir a estabilidade protéica pós-traducional. Essa estratégia molecular de expressão pode constituir uma alternativa interessante para o desenvolvimento de produtos biotecnológicos mais baratos e eficientes para sua utilização como reagentes terapêuticos e diagnósticos. _________________________________________________________________________________ ABSTARCT

Plants present various advantages for the production of biomolecules, including low risk of contamination with prions, viruses and other pathogens, scalability, low production costs, and available agronomical systems. Plants are also versatile vehicles for the production of recombinant molecules because they allow protein expression in various organs, such as tubers and seeds, which naturally accumulate large amounts of protein. Among crop plants, soybean is an excellent protein producer. Soybean plants are also a good source of abundant and cheap biomass and can be cultivated under controlled greenhouse conditions. Under containment, the plant cycle can be manipulated and the final seed yield can be maximized for large-scale protein production within a small and controlled area. In this study we obtained different transgenic soybean lines containing the genes that codify the human proinsulin, the human growth hormone (hGH) and the human coagulation factor IX (FIX), under control of tissue-specific regulatory sequences that target the expression to the PSVs. The transgenic lines were characterized on the transcriptional and translational levels, and the recombinant expression of the hGH and the FIX reached 2.9 and 0.23% TSP respectively, which indicate a potential to produce up to 9 and 0.8 g of recombinant protein/Kg seeds. The N-terminal sequencing with nanoLC-MSE demonstrated that all the tryptic fragments analyzed showed the expected sequences and the molecular masses. The biological activities of the recombinant hGH and the FIX were also determined, and demonstrated that targeting to the PSVs was an interesting expression tool to elevate the post-translational stability. This strategy for the improved molecular expression can constitute an important alternative for the development of cheaper and safer biotechnological products that can be used as therapeutic tools and diagnose reagents in the future.