Purificação e caracterização estrutural de uma α-amilase de Cryptococcus flavus expressa em Saccharomyces cerevisiae “MFL”

Abstract

A crise energética que vem atualmente sendo estabelecida mundialmente deve-se principalmente à elevação de preços e escassez de fontes de petróleo. Em virtude disso, novas fontes para a produção de combustíveis tem sido exploradas, entre elas, o amido para a produção de bioetanol. Para fermentação alcoólica o amido deve ser clivado para liberação das moléculas de glicose presentes em sua estrutura. Uma das enzimas necessárias nesse processo é a α-amilase, responsável pela hidrólise das ligações α-1,4 do amido liberando maltose e oligossacarídeos. Neste trabalho apresentamos estudo biofísico e estrutural de uma α-amilase (Amy1), proteína da levedura Cryptococcus flavus, expressa em Saccharomyces cerevisiae. A Amy1 foi obtida a partir do crescimento da levedura recombinante por 72 horas em meio de cultura com extrato de levedura como fonte de nitrogênio e purificada por cromatografia de troca iônica e de exclusão molecular. Essa enzima apresenta atividade ótima em pH 5,5. Estudos de dicroísmo circular (CD) da Amy1 recombinante em comparação com a proteína selvagem mostraram que a expressão em um organismo diferente não alterou significativamente a estrutura da α-amilase recombinante. A estrutura secundária da Amy1 recombinante em água a 25°C é constituída de 9,1% de α-hélice e 32,7% de folhas-β e da Amy1 selvagem de 8,2% de α-hélice e 34,7% de folhas-β. Nenhuma das proteínas apresentou padrão de desnaturação com a elevação da temperatura até 95°C, indicando a estabilidade estrutural dessas moléculas. Estudos de atenuação de fluorescência, utilizando atenuadores carregados e neutros e ajustes de Stern-Volmer, revelaram que a proteína recombinante apresenta uma população de triptofano predominantemente semi-enterrada. O microambiente desse aminoácido é parcialmente carregado positivamente, indicado pelos valores das constantes de Stern-Volmer (Ksv) obtidas para a partir da atenuação de fluorescência pela acrilamida, cloreto de césio e iodeto de potássio, nos pHs 5,5; 7,0 e 9,0. Mudanças conformacionais da proteína ocorrem em pHs neutro e alcalino levando a inativação da enzima. No entanto, as mudanças ocorridas em pH 5,5 são importantes para o aumento da atividade catalítica dessa enzima. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT

The energy crisis currently established worldwide has been the main motivation to explore new sources for fuel production, as starch used for bioethanol. In this process the α-amylase, responsible for the hydrolysis of the starch α-1-4 covalent bonds, is used to release maltose and oligosaccharides. Here, we present structural and biophysical studies of the α-amylase (Amy1) from yeast Cryptococcus flavus, expressed in Saccharomyces cerevisiae. The Amy1 was obtained from recombinant yeast in culture medium for 72 hours with yeast extract as nitrogen source. The enzyme was purified by ion exchange and molecular exclusion chromatography and presents optimal activity in pH 5.5. Structural studies using circular dichroism (CD) spectroscopy showed that recombinant and wild type amylases (Amy1) are structurally similar. The secondary structure content of recombinant and wild Amy1 in water at 25°C consists of 9.1% and 8.2% α-helix, 32.7% and 34.7% β-sheet, respectively. The amylases were characterized as thermal stable proteins, since none denaturation profile was observed under increasing temperature up to 95°C. Fluorescence decay studies using charged and neutral quenchers and Stern-Volmer approximation revealed that the recombinant protein has a population of tryptophan predominantly semi-buried. The tryptophan microenvironment is partially positively charged, indicated by the values of the Stern-Volmer constant (KSV) obtained from attenuation of fluorescence by acrylamide, cesium chloride and potassium iodide at pH 5.5, 7.0 and 9.0. Protein conformational changes occur in neutral and alkaline pH leading to inactivation of the enzyme. However, at pH 5.5 these conformational changes are important for increasing the catalytic activity of this enzyme.