O sistema celulolítico de Penicillium echinulatum : análise da ultraestrutura miceliana e influência de moduladores epigenéticos

Abstract

Neste trabalho foi analisado, por microscopia eletrônica de varredura, o crescimento do fungo filamentoso Penicillium echinulatum sobre bagaço de cana-de-açúcar e características morfológicas foram descritas. Essa espécie apresentou hifas ramificadas e com septação. Os conídios apresentaram formato globoso a subgloboso e diâmetro entre 3,5 a 5m. O crescimento do microrganismo sobre o bagaço causou a ruptura parcial desse substrato, observada a partir do aspecto quebradiço e esfarelado das fibras, assim como pela propagação das hifas entremeando as fibrilas. Por meio de estudos de qRT-PCR, foi comparado o nível de acúmulo de transcritos dos genes egl, cbh, bgl e swo de P. echinulatum, cultivado em condições indutoras ou repressoras para genes do complexo celulolítico e em diferentes tempos de crescimento. Em condição indutora, esse fungo apresentou um pico de acúmulo de transcritos dos genes egl, cbh e swo, após 48h de cultivo. Após 24h, foi observado por microscopia eletrônica de trasmissão alterações ultraestruturais condizentes com células com elevada função de produção e secreção de proteínas. O gene bgl, por sua vez, não apresentou indução do nível de transcritos comparável aos demais genes, mesmo quando cultivado em fonte celulósica. A análise quantitativa do acúmulo de transcritos desses genes também foi investigada na presença de drogas com ação inibitória da atividade de histonas desacetilases (Tricostatina A - TSA e butirato de sódio - NaBut), ou inibidoras da atividade de DNA metiltransferases (5-aza-2’-deoxicitidina – 5-AZA). A droga 5-AZA não causou alteração do acúmulo de transcritos de genes de celulases. Com as drogas NaBut e TSA, observou-se a redução do nível de transcritos para os genes egl, swo e cbh, em comparação a condição controle (ausência de droga). Utilizando-se concentrações menores desses dois compostos, somente foi observada a redução do acúmulo de transcritos dos genes egl e swo sob a ação de TSA. Não foi observada influência dos moduladores epigenéticos sobre a atividade enzimática dos sobrenadantes de culturas desse fungo sobre substratos celulósicos. Adicionalmente, o perfil proteico dos sobrenadantes de cultura não apresentou alteração sob efeito dessas drogas. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT

Penicillium echinulatum morphological characteristics and its growth on sugarcane bagasse were evaluated by scanning electron microscopy. This species presented septated and branched hyphae. P. echinulatum conidia presented globose/subglobose shape and diameter between 3.5 and 5m. The growth of this microorganism on sugarcane bagasse caused partial rupture of the substrate structure. The influence of different carbon sources (swollen cellulose or glucose) on the accumulation of transcripts of bgl, egl, swo and cbh genes were determined using real-time quantitative reverse-transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR). Under induction conditions, transcription of egl, cbh and the swo genes was hyper induced after 48h incubation. On the other hand, the transcription of bgl gene was not induced to the same level of the other genes, even under induction conditions. Moreover, after 24h, mycelial ultrastructure revealed features of a typical protein production and secretion cell. The impact of epigenetic modifiers Trichostatin A (TSA), sodium butyrate (NaBut) and 5-aza-2’-deoxycitidine (5-AZA) on the transcription of bgl, egl, swo and cbh genes were determined using qRT-PCR. The level of P. echinulatum celulase transcripts was not altered by 5-AZA. On the other hand, TSA and NaBut reduced egl, swo and cbh transcripts levels in comparison with the control condition (drug absence). Lower concentrations of these two compounds were used and only TSA had effect on transcripts levels of egl and swo genes. No difference in enzyme activity towards cellulosic substrates and also in the secreted proteins electrophoretic profile was observed under the influence of these epigenetic modifiers.