Regulação transcricional de genes de hidrolases em fungos filamentosos : sistemas PacC/CreA em humicola grisea var. thermoidea e sistema Xyr1 em trichoderma reesei

Abstract

O pH ambiental é um sinal importante para fisiologia de fungos, intervindo na regulação da transcrição de vários genes. Em fungos filamentosos e leveduras, PacC é um importante fator transcricional que regula a expressão de genes tanto em pH ácido como alcalino. A produção de enzimas envolvidas na bioconversão de biomassa vegetal é regulada principalmente no nível da transcrição. No entanto, o envolvimento da via de regulação por pH na expressão de enzimas lignocelulolíticos não tem sido extensivamente estudado. Nosso grupo havia demonstrado anteriormente que o deuteromiceto termofílico Humicola grisea var. thermoidea é um potente produtor de celulases, apresentando um considerável potencial biotecnológico para bioconversão de resíduos agrícolas. Nossos resultados sustentam a existência de uma via de regulação por pH para as glicosil hidrolases em H. grisea. Neste trabalho, foram realizadas análises quantitativas por RT-PCR em tempo real para vários transcritos de H. grisea. O perfil transcricional de oito genes codificadores de enzimas lignocelulolíticas (cbh1.1, cbh1.2, egl1, egl2, egl3, egl4, bgl4 e xyn1) e de dois fatores de transcrição (pacC e creA) foi avaliado na presença de glicose ou de bagaço de cana-de-açúcar em condições de pH ácido e alcalino. A análise por qRT-PCR revelou uma indução forte e precoce de quase todos os genes de enzimas lignocelulolíticas, de uma maneira sinérgica quando o fungo foi cultivado com a fonte de carbono complexa e em condições alcalinas (pH 8,0). A única exceção foi egl4, que foi induzido por pH ácido. Um padrão oposto para a expressão dos dois fatores transcricionais foi observado. Enquanto pacC foi induzido em condições alcalinas e fortemente reprimido na presença de glicose, creA foi induzido por glicose e reprimido em condições alcalinas. Os dados de perfil de transcrição, combinados com a análise da ligação in vitro de PacC e CreA aos promotores dos genes analisados, apóiam a repressão por carbono, mediada por CreA, e a via de regulação por pH, mediada por PacC em H. grisea. Além disso, ensaios de mobilidade eletroforética (EMSAs) com o promotor de pacC mostraram que, in vitro, PacC e CreA competem pelo mesmo sítio de ligação. Tomados em conjunto, estes dados corroboram as hipóteses de que PacC possa ser o mediador da regulação influenciada pelo pH e de que a repressão por glicose, possivelmente atribuída a CreA, é capaz de sobrepujar a ação indutória do pH alcalino. Temos ainda evidências de que CreA também esteja envolvido na repressão de PacC, estabelecendo uma interação entre os dois sistemas regulatórios. O foco do segundo capítulo desse trabalho foi a produção e caracterização de Xyr1 (regulador de xilanases 1), que é o principal fator transcricional que atua na regulação da expressão dos genes codificadores de xilanases em Trichoderma reesei. Os resultados apresentados mostraram a bem sucedida produção heteróloga da versão completa da proteína Xyr1, algo até então inédito entre reguladores de xilanases em fungos filamentosos. Nossas análises empregando técnicas de interação DNA-proteína e géis nativos indicaram que Xyr1 pode naturalmente formar homodímeros em solução. Contudo, a dimerização não é fundamental para a interação com o DNA, o que implica em uma dinâmica complexa de ligação ao promotor do gene xyn1. São possíveis as formas de monômero, dímero e interação com ambos os motivos do sítio palindrômico. A capacidade de dimerização do fator fortalece a proposição de modulação adicional da atividade de Xyr1 por meio de possíveis interações proteína-proteína com outros fatores transcricionais, sendo candidatas as proteínas Ace1 e Ace2. O papel de modificações pós-traducionais tem sido apontado como crucial na regulação mediada por Xyr1. Mostramos que a fosforilação possivelmente está envolvida na regulação da atividade de Xyr1, sendo necessária para a interação DNA-proteína in vitro, mas sem afetar a formação de dímeros. Apresentamos ainda indícios de modulação alostérica de Xyr1 que depende tanto da interação com o DNA quanto, possivelmente, com carboidratos, o que torna mais complexo este modelo de regulação. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT

Environmental pH is an important signal in fungal physiology, acting at transcriptional regulation of several genes. In filamentous fungi and yeasts, the PacC zinc-finger transcription factor regulates gene expression in response to changes of external pH. The production of enzymes involved in plant cell wall breakdown is regulated mainly at the transcriptional level. Nonetheless, the involvement of the pH-related regulatory pathway in the lignocellulolytic enzymes expression has not been extensively studied. We have demonstrated that the thermophilic deuteromycete Humicola grisea var. thermoidea is a potent cellulases producer, presenting a considerable potential for agricultural wastes bioconversion processes. Previous results of our group support the existence of a pH regulatory pathway in H. grisea var. thermoidea. In this work, we have performed a time course transcription analysis of several H. grisea genes by quantitative real time RT-PCR. Eight enzyme genes (cbh1.1, cbh1.2, egl1, egl2, egl3, egl4, bgl4 and xyn1), and two transcription factors genes (pacC and creA) were analyzed in the presence of simple (glucose) or complex (sugarcane bagasse) carbon source, in acid and alkaline medium conditions. The qRT-PCR analyses revealed an early and strong induction of almost all glycoside hydrolase genes transcription, in a synergistic way, when the mycelia were grown in the presence of the complex carbon source, under alkaline conditions (pH 8.0). The only exception was egl4, which was acid-induced. An opposite pattern was observed for the expression of the two transcription factors. While pacC was induced in alkaline conditions and strongly repressed in presence of glucose, creA was induced by glucose and repressed in alkaline conditions. The transcriptional profile data combined with the analysis of the in vitro binding of PacC and CreA transcription factors to the promoters support the CreA-mediated carbon repression and the PacC-related pH regulation of H. grisea cellulase and xylanase encoding genes. Moreover, electrophoretic mobility shift assays (EMSAs) employing the upstream regulatory sequences of pacC showed that an in vitro interaction occurs between the proteins PacC and CreA on the pacC upstream regulatory sequence, with both factors competing for the same binding site. Taken together, this data corroborate our previous evidences, supporting the existence of a pH transcriptional regulatory pathway in H. grisea, mediated by PacC. Moreover, PacC is probably transcriptionally auto-regulated and may be subject to the carbon repression mechanism mediated by CreA. The second chapter of this work describes the production and characterization of Xyr1 (xylanase regulator 1), which is the main transcription factor that acts regulating the expression of xylanase encoding genes in Trichoderma reesei. The results showed the successful heterologous production of the full version of Xyr1, something never previously described for xylanases regulators in filamentous fungi. Our analyses employing techniques of DNA-protein xviii interactions and native gels indicated that Xyr1 can form homodimers in solution. Nevertheless, dimerization is not essential for the interaction with DNA, suggesting a complex binding dynamics to the xyn1 promoter region (as monomer, dimer and interacting with both palindromic binding sites). The dimerization capacity of Xyr1f strengthens the proposition of an additional modulation for this factor activity, probably by protein-protein interactions with other transcription factors, such as Ace1 and Ace2. A crucial role for post-translational modifications was proposed for gene regulation mediated by Xyr1. We initially showed that phosphorylation has a possible role in the regulation of Xyr1 activity, being necessary for the DNA-protein interactions in vitro, but not affecting the dimer formation. Additionally, we present evidence suggesting an allosteric modulation of Xyr1, dependent on interactions, both with DNA and carbohydrates, which adds an additional degree of complexity to this regulatory model.