Caracterização do secretoma de Aspergillus oryzae crescido em estado sólido de bagaço de cana

Abstract

A cana de açúcar é a segunda cultura mais abundante no país, e tem como resíduo o bagaço de cana, o qual é constituído por células vegetais que possuem uma parede celular composta por celulose, hemicelulose e pectina, além da lignina. A biomassa lignocelulósica armazena grande quantidade de energia química, que pode ser convertida em diversas outras fontes energéticas. Fungos filamentosos são microrganismos capazes de produzir e secretar enzimas variadas para utilizar a parede celular vegetal como fonte de carbono. Nesta dissertação foi analisado o secretoma de Aspergillus oryzae crescido em estado sólido de bagaço de cana como fonte de carbono. Foram testadas duas soluções para a extração do secretoma, a) tampão acetado de sódio 0,25mM, pH 5,0 e b) tampão acNa 0,25mM, pH 5,0, 0,1%Tween 80. As amostras foram submetidas às análises enzimáticas, eletroforéticas e por espectrometria de massas (LC-MS/MS). As análises enzimáticas e eletroforéticas mostraram que não houve diferença entre os dois métodos de extração. Além disso, o detergente Tween 80 aparenta aumentar a extração de proteínas vindas do bagaço de cana, o que não é desejável para a análise por espectrometria de massas. A comparação do secretoma de A. oryzae em estado sólido com o secretoma deste em cultura submersa usando meio contendo bagaço mostrou diferenças significativas, sendo o secretoma em estado sólido mais diversificado enquanto o secretoma em cultura submersa apresentou maior abundância de determinadas proteínas. A análise do secretoma produzido em estado sólido por espectrometria de massas permitiu a identificação de 47 proteínas não redundantes, sendo 19 relacionadas à degradação de biomassa lignocelulósica. O polimorfismo enzimático em A. oryzae pode ter sido a justificativa para o baixo número de identificações. As proteínas intracelulares identificadas podem ter sido consequência do processo de extração, mas podem também ter sido secretadas por vias não convencionais, da mesma forma que ocorre em protozoários. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT

The sugarcane crop is the second more abundant crop in Brazil, and has as waste sugarcane bagasse, which is constituted by plant cells with a cell wall composed of cellulose, hemicellulose and lignin. The lignocellulosic biomass stores a large amount of chemical energy, which can be converted to another sources of energy. Filamentous fungi are a group of organisms that are able to secrete a variety of proteins to disrupt cell wall structure for further carbon assimilation. In this work, Aspergillus oryzae was submitted to solid state-fermentation and it was analyzed two different solutions for extraction of proteins secreted by the fungus as follows: a) 0.25 mM sodium acetate buffer, pH 5; b), 0.25 mM sodium acetate buffer, pH 5, 0.1% Tween 80. The samples were analyzed by enzymatic assays, electrophoretical profile and mass spectrometry (LC-MS/MS) analysis. Enzymatic and electrophoretical analysis showed that there were no differences between extraction with sodium acetate buffer and the extraction buffer with Tween 80. Moreover, Tween 80 seems to increase sugarcane bagasse proteins solubilization in the sample, which is not desirable for MS analysis. The comparison between A.oryzae’s secretome in solid-state culture and in submerged culture using sugarcane bagasse as carbon source showed remarkable differences, being the solid-state secretome more complex and the submerged-culture secretome with some more abundant proteins. Mass spectrometry analysis of solid-state secretome allowed the identification of 47 non redundant proteins, and 19 of them were related with biomass degradation. The high degree of enzymatic polymorphisms in A. oryzae might be the reason of few identified proteins. Intracellular proteins may be a consequence of extraction process, but they could be secreted in an unconventional secretion pathway, as those ones observed in protozoan parasites.