Development of a molecular method for detection and identification of Xanthomonas campestris pv. viticola

Abstract

ABSTRACT

Com o objetivo de desenvolver um método molecular para detecção e identificação de Xanthomonas campestris pv. viticola (Xcv), agente causal do cancro bacteriano da videira, oligonucleotídeos (primers) foram desenhados com base na seqüência parcial do gene hrpB. As combinações de primers Xcv1F/Xcv3R e RST2/Xcv3R que amplificaram fragmentos de 243 e 340 pb, respectivamente, foram testadas quanto à especificidade e sensibilidade para detecção do DNA de Xcv. Com os dois pares de primers, amplificação foi positiva com o DNA de 44 isolados de Xcv, mas também com quatro isolados de X.c. pv. mangiferaeindicae e cinco de X. axonopodis pv. passiflorae. Contudo, a digestão dos produtos de PCR permitiu diferenciar Xcv dos isolados desses patovares. Nenhum dos dois pares de primers amplificou o DNA de videira, nem de 20 bactérias não patogênicas isoladas da flora da videira, ou de 10 isolados de outros seis gêneros de bactérias fitopatogênicas. A sensibilidade dos primers Xcv1F/Xcv3R e RST2/Xcv3R foi de 10 pg e 1 pg de DNA purificado de Xcv, respectivamente. O limite de detecção de RST2/Xcv3R foi de 104 UFC/ml, mas empregando-se uma segunda rodada de amplificação com o primer interno Xcv1F, esse limite foi de 102 UFC/ml. Não foi possível detectar por PCR a presença de Xcv usando-se, diretamente na reação, o extrato do macerado de pecíolos de videira previamente inoculados. Entretanto, amplificações foram positivas quando se utilizou uma etapa de enriquecimento em meio de cultura antes da PCR. Detectou-se Xcv em 1 µl da suspensão obtida do lavado das placas e em uma suspensão obtida a partir de uma única colônia. A identidade da bactéria foi confirmada pela análise de RFLP dos produtos de amplificação dos primers RST2/Xcv3R com HaeIII.