Expressão de antígeno tetra-epitopo do vírus Dengue em cloroplastos de alface e avaliação do seu potencial diagnóstico para detecção de anticorpos IgG contra os quatro sorotipos da Dengue

Abstract

A Dengue hoje está presente em mais de 100 países, causando aproximadamente 100 milhões de casos da doença. O diagnóstico laboratorial é de fundamental importância, devido a semelhança de sintomas confundidos com outras doenças como a Febre amarela, Sarampo, Rubéola e Influenza. Técnicas sorológicas como o ELISA são amplamente empregadas para o diagnóstico, entretanto, devido ao uso de extrato bruto viral como fonte de antígeno, ocorrem problemas de reações cruzadas, variação de qualidade e alto custo de produção. Objetivando a diminuição destes problemas com ensaios convencionais de ELISA, antígenos virais recombinantes têm sido produzidos e utilizados em ensaios diagnósticos. Neste trabalho utilizou-se o sistema de transplastomia em alface para a produção de um antígeno recombinante tetra-epitopo, o que permitiu o emprego do extrato bruto proteico de cloroplastos, sem purificação, na detecção sorológica de anticorpos IgG contra os 4 sorotipos da Dengue. O antígeno tetra-epítopo desenvolvido, compreende a região de epítopos que vai do aminoácido 34 ao 57, entre os domínios I/II da proteína do envelope do vírus. O antígeno é composto pelos sorotipos na ordem 4-3-2-1 unidos por linker de 5 glicinas. Na região C terminal adicionou-se cauda de hexa-histidina com o intuito de facilitar a purificação. O ELISA para detecção de IgG, apresentou uma sensibilidade geral de 71%, e especificidade de 100% para soros onde não havia sido determinado a fase e tipo de infecção. Houve diferença de sensibilidade dentre os sorotipos, que foi estimada em 91.6%, 86.6%, 75.0%, e 18,2% para os sorotipos de DENV-1-4, respectivamente. Não observou-se reação cruzada com soros positivos para Febre amarela, Rubéola e Sarampo. Na avaliação com soros pareados, o ELISA revelou uma sensibilidade maior na fase convalescente do que na aguda da doença, tanto para infecções primárias quanto secundárias. A sensibilidade geral para os dois perfis de infecções desconsiderando a fase da doença (aguda ou convalescente), revelou uma sensibilidade geral de 89% para as infecções primárias, e 96% para as infecções secundárias. Quanto à planta transplastômica, esta ainda apresenta um perfil de transformação heteroplásmico. Almeja-se a obtenção de uma planta homoplásmica que provavelmente será obtida através da seleção em meio seletivo. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT

Currently Dengue occurs in more than 100 countries causing about 100 million cases of Dengue disease per year. Laboratory diagnosis is crucial, because of the similarity of symptoms confused with other diseases such as Yellow Fever, Measles, Rubella and Influenza. Serological techniques as ELISA are widely used for the diagnosis; however, due to the use of crude extract as the viral antigen source, problems may occur as cross-reactions, variation in quality and high production costs. Aiming to decrease these problems with conventional ELISA kits, recombinant viral antigens have been produced and used in diagnostic kits. In this study lettuce transplastomic system was used to produce a recombinant tetra-epitope antigen, which allowed the use of crude protein extract from chloroplasts, without purification, for serological detection of IgG antibodies against the four Dengue serotypes. The tetra-epitope antigen developed, comprising the epitope region of position 34-57 amino acid, which is located between domains I / II of the virus envelope protein. The antigen is composed of serotypes in the following order 4-3-2-1 joined by 5 glycines linkers. In the C terminal region, a hexa-histidine tail was added for purification. The ELISA for detection of IgG in patients’ sera, showed an overall sensitivity of 71% and specificity of 100% using sera which had not been determined the phase and type of infection. There was a difference in sensitivity between the serotypes that was estimated around 91.6%, 86.6%, 75.0%, and 18,2%, for DENV 1-4 serotypes, respectively. No cross-reaction was observed with positive sera for Yellow Fever, Rubella and Measles. In evaluation with paired sera, the ELISA showed greater sensitivity in convalescent than in acute phase of disease development for both, primary and secondary infections. The overall sensitivity for the two profiles infections not considering the disease phase (acute or convalescent), revealed 89% for primary infections, and 96% for secondary infections. As for the transplastomic plant, it still has a heteroplasmic transformation profile. Probably the homoplasmic plant may be obtained by selection on selective medium.