Análise da saliva total de portadores de fibrose cística : composição inorgânica e a abordagem proteômica

Abstract

A Fibrose Cística (FC) é uma doença hereditária autossômica, recessiva e letal que apresenta certas dificuldades na realização do diagnóstico precoce e preciso. Devido ao comprometimento patológico essa doença assume grande importância e o diagnóstico precoce é decisivo para um melhor prognóstico. Este estudo teve por objetivo determinar a composição inorgânica e análise proteômica da saliva total de indivíduos com FC e identificar biomarcadores para uso no diagnóstico da doença. Foram coletadas amostras de saliva de habitantes da região Centro Oeste do Brasil: 12 indivíduos homozigotos para a mutação ?•F 508 (4 mulheres, 8 homens), 12 heterozigoto para ?ýF 508 (5 mulheres, 7 homens), 13 indivíduos com FC com mutações não identificadas (6 mulheres, 7 homens), 8 indivíduos com diagnóstico duvidosos para FC ( 5 mulheres, 3 homens) e 43 indivíduos saudáveis (23 mulheres e 20 homens). Indivíduos com dúvida no diagnóstico para FC ou que não cumpriram os requisitos para compor o grupo controle foram excluídos das análises. Os teores dos elementos traço Al, As, B, Ba, Ca, Cd, Co, Cr, Cu, Fe, Hg, K, Mg, Mn, Mo, Na, Ni, Pb, Se, Si, Sr, Ti, V e Zn na saliva foram avaliados por espectrometria de massa com plasma de argônio acoplado indutivamente (ICP-MS), espectrometria de emissão óptica com plasma de argônio acoplado indutivamente (ICP-OES) e espectrometria de absorção atômica (AAS). O perfil protéico foi estudado por eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de Sodium Dodecyl Sulfate (SDS-PAGE), por eletroforese bidimensional (2-DE) e análise de bases peptídicas por espectrometria de massa (MS/MS). Os elementos Na e K apresentaram, em média, teores mais elevados, enquanto, V, Cr e Se menos elevado quando comparados a indivíduos saudáveis, o elemento As foi detectado apenas no grupo de indivíduos saudáveis (p<0,05). Nas análises por eletroforese, o grupo com FC apresentou uma banda nítida de massa molecular de 38 kDa, não visualizada nos indivíduos sem a doença. A espectrometria de massa identificou a uma imunoglobulina (IgA), a qual esta visivelmente expressa nos indivíduos com FC. Existe diferença significante entre a saliva de indivíduos com FC e às de indivíduos saudáveis. Foi também identificado diferenças no perfil protéico. Com os resultados deste trabalho podemos inferir que a saliva total estimulada é uma fonte potencial para estudos que possam corroborar no desenvolvimento de um método de diagnóstico precoce e preciso da FC. ______________________________________________________________________________________ ABSTRACT

Cystic Fibrosis (CF) is an autossomic recessive lethal inherited disease that presents certain difficulties for an early and accurate diagnosis. Due to its pathological character this disease assumes great importance and early diagnosis is of paramount importance for a good prognostic. The objective of this study was to determine the inorganic composition and the proteomic analysis of stimulated whole saliva obtained from CF and identify biomarkers for CF diagnosis. Samples were collected from individuals living in the Brazilian West Central Region: 12 homozygous for mutation ?•F 508 (4 females; 8 males); 12 heterogeneous for mutation ?•F 508 (4 females; 8 males); 13 with unidentified CF mutations (6 females; 7 males); 8 with doubtful CF diagnosis (5 females; 3 males); and 43 healthy individuals (23 females; 20 males) for the control group. Samples from individuals with doubtful diagnosis as well as from those that did not fulfill the basic requirements to compose the control group were discarded. Concentration of trace elements Al, As, B, Ba, Ca, Cd, Co, Cr, Cu, Fe, Hg, K, Mg, Mn, Mo, Na, Ni, Pb, Se, Si, Sr, Ti, V e Zn were evaluated using mass spectrometer with inductively coupled argonium plasma (ICP-MS), optical emission spectrometer with inductively coupled argonium plasma (ICP-OES), and atomic absorption spectrometer (AAS). Protein profile was accessed by polyacrylamide gel electrophoresis 15% in presence of Sodium Dodecyl Sulfate (SDS-PAGE), by bidimensional electrophoresis (2D), and analysis of the peptide bases by mass spectrometry (MS) In every analyses, results obtained for CF individuals were compared to those for healthy subjects. Average concentration values for Na and K were higher in CF patients as compared to healthy individuals. In contrast, V, Cr, and Se, were lower. Element As was detected only in the healthy group (p<0,05). In the SDS-PAGE analysis CF patients presented a distinct band with molecular mass between 30 and 45 kDa not visualized in the healthy subjects. By 2D electrophoresis associated with mass spectrometry it was possible to identify a heavy chain immunoglobulin (C region) of Iga¥(IgA) clearly visible in CF patients. There were significant differences between saliva from healthy and CF individuals as well as in their protein profile. Results obtained in the present study indicate that stimulated whole saliva is a potential source for studies that may corroborate the development of an early and accurate screening method.