Descoberta e validação de marcadores SNPs por sequenciamento de alta performance do genoma estrutural e por genotipagem por sequenciamento (GBS) de arroz de sequeiro (Oryza sativa spp. japonica)

Abstract

Entre as recentes tecnologias que podem ser aplicadas na detecção e desenvolvimento de marcadores moleculares, destaque tem sido dado à tecnologia NGS (Next Generation Sequencing), que possibilita a detecção de polimorfismo de DNA através da comparação de milhões segmentos de leitura (reads) do genomas estruturais de diferentes cultivares de uma espécie. O polimorfismo de DNA mais abundante, revelado por esta estratégia, é o polimorfismo de base de DNA (substituição ou transição de base), conhecido como SNP (Single Nucleotide Polymorphism). Neste trabalho foram utilizados resultados de sequenciamento do genoma estrutural de seis variedades de arroz japonica tropical para detectar, selecionar e desenhar painéis multiplex para genotipagem automatizada e simultânea de centenas de marcadores SNP em acessos de arroz de sequeiro. Foram desenvolvidos dois painéis multiplex (SNP1 e SNP2) com 768 SNPs distribuídos pelo genoma de arroz. Os painéis foram avaliados quanto à eficiência de clusterização de intensidade do sinal de fluorescência para a definição dos genótipos, à acurácia de genotipagem em testes de prova e contraprova, à capacidade de discriminação de acessos do Banco de Germoplasma e, finalmente, ao potencial emprego na construção de mapas genéticos de cruzamentos de interesse do programa de melhoramento genético. Os testes realizados comprovaram a eficiência da genotipagem e a elevada concordância de genótipos em testes de prova e contraprova. Observou-se que erros de genotipagem ocorrem a uma taxa muito baixa (0,33%). Cerca de 70% dos SNPs possuem o alelo mais comum com frequência entre 0,50 e 0,75, e são poucos os SNPs (<3%) com frequência do alelo mais comum acima de 0,95. O poder combinado dos painéis na confirmação de identidade genética ou na discriminação de genótipos é extremamente elevado. A segregação e a herança dos alelos dos SNPs que compõem os dois painéis foi testada em duas populações de linhagens puras recombinantes, possibilitando a construção de dois mapas genéticos (cruzamentos Chorinho x Puteca e Chorinho x Amaroo). O processo de genotipagem utilizando painéis SNP em genotipador automático é simples, rápido e eficiente. Os painéis SNP1 e SNP2, portanto, possuem ampla aplicação no melhoramento varietal e são recomendados para análise genética de acessos japonica tropical de arroz do Brasil. Foi testada ainda uma nova metodologia de genotipagem por sequenciamento (Genotyping by Sequencing – GBS) que emprega sequenciamento em escala do genoma estrutural após a redução de complexidade do genoma pelo do uso de enzimas de restrição. O emprego de GBS possibilita amostrar o polimorfismo de SNPs em regiões amplamente distribuídas ao longo do genoma utilizando, por exemplo, enzimas sensíveis a metilação, evitando dessa forma o sequenciamento massal de regiões repetitivas e complexas, que dificultam o processo de análise. Os experimentos de GBS foram realizados com acessos de arroz de sequeiro com alta diversidade genética, que compõem a Coleção Nuclear Temática de Tolerância a Seca de arroz da Embrapa. Os resultados obtidos neste trabalho comprovam que a metodologia de genotipagem por sequenciamento tem amplo potencial na detecção e seleção de um alto número de marcadores SNPs. Contudo, verificou-se nas condições testadas um aparente excesso de genótipos heterozigotos nas amostras avaliadas. Além disso, em testes de prova e contraprova, o erro de genotipagem estimado foi muito elevado em algumas comparações, independentemente da cobertura genômica mínima utilizada na detecção dos SNPs ou do valor de qualidade mínima do SNP detectado. Assim, verificou-se que o ensaio GBS proporciona um alto número de marcadores SNPs capazes de detectar polimorfismo de DNA em acessos de arroz, mas a acurácia da genotipagem foi considerada baixa nas comparações de prova e contraprova realizadas. Portanto, é necessário um aperfeiçoamento do ensaio GBS para a seleção de marcadores SNP fidedignos, passíveis de uso em escala na genotipagem de arroz. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT

Among the recent technologies that can be used to detect and develop molecular markers, Next Generation Sequencing (NGS) has received special attention. This technology allows the detection of DNA polymorphism by the comparison of millions of DNA fragments (reads) obtained from different individuals of a species. The most abundant DNA polymorphism revealed by this strategy is known as SNP (Single Nucleotide Polymorphism). In this work, the genome sequencing results of six different varieties of tropical japonica rice have been analyzed to detect, select and design hundreds of SNP markers to construct multiplex panels for automated simultaneous genotyping of rice germplasm accessions. Two multiplex panels (SNP1 and SNP2), composed of 768 SNPs evenly distributed across the genome, were developed and validated for rice genotyping. The panels were initially evaluated for clustering efficiency of fluorescence signal intensity for genotype calling and for genotype accuracy in test-retest reliability assays. Then, they were examined for the ability to discriminate accessions of the rice germplasm collection and for the potential use in genetic mapping. The results confirmed that the panels have a high genotyping efficiency and accuracy. Data was obtained in more than 96% of the SNPs evaluated and a very low genotyping error rate was observed (0.33%). Most SNPs (70%) presented a frequency between 50-75% for the most common allele, with only a few SNPs having frequency above 95%. The combined power of SNP panels to confirm genetic identity or to discriminate germplasm accessions was very high. Allelic segregation and inheritance of SNP markers was tested in different recombinant inbred line populations, allowing for the construction of two genetic maps, derived from the crossings between Chorinho x Puteca and Chorinho x Amaroo. Plant genotyping based on SNP panels in automated genotypers is a simple, fast and efficient method. Both SNP panels have a broad application in breeding and are recommended for use in genetic analyses of tropical japonica rice germplasm. A new genotyping by sequencing (GBS) methodology was also tested in the present study. This methodology is based on high scale genome sequencing, after total DNA is submitted to complexity reduction using enzymatic restriction digestion. GBS is used to detect polymorphism in regions distributed across the whole genome. GBS assays were conducted using tropical japonica rice varieties with high genetic diversity, which compose Embrapa’s Drought Tolerance Core Collection. The results indicated that the GBS methodology is useful for the detection and selection of a high number of SNP markers. However, a very high amount of heterozygous genotypes was detected in the analyzed samples. Also, genotype accuracy estimates indicated that the genotyping error rate of the GBS assay was too high, independently of the minimum genomic coverage used for SNP detection or the minimum quality value of the detected SNP. Therefore, the GBS assay can provide a high number of SNP markers capable of detecting DNA polymorphism in tropical japonica rice, but the accuracy was considered low in the test and re-test comparisons performed in the present study. Improvements in the GBS assay are necessary in order to obtain accurate genotypes in large scale that can be useful to japonica rice breeding.