Criopreservação e autotransplante heterotópico de tecido ovariano de gatas domésticas

Abstract

No Brasil, todas as espécies de felinos selvagens estão sob risco de extinção. Desta forma, técnicas de reprodução assistida aplicáveis a tais espécies são recursos valiosos para a conservação das mesmas. O gato doméstico (Felis catus) tem sido um excelente modelo experimental para estudos que visem aplicação em felinos selvagens. O presente trabalho teve como objetivos testar o efeito de diferentes protocolos de criopreservação, além da eficácia do autotransplante ovariano em manter a viabilidade e retomar o desenvolvimento de folículos pré-antrais inclusos em ovários de gatas domésticas. Um teste de criopreservação foi realizado comparando a eficácia de etilenoglicol (EG), dimetilsulfóxido (DMSO) e a associação de ambos (EG+DMSO) na preservação de folículos a aovarianos após descongelamento (1 Etapa). Na 2 Etapa do experimento, cinco gatas foram submetidas à cirurgia de ovariohisterectomia bilateral. Os animais tiveram seis fragmentos de ovário fresco transplantados para o tecido subcutâneo da região dorsal do pescoço.Foram realizadas cinco biopsias (7, 14, 28, 49 e 63 dias). O tecido ovariano foi fixado em Carnoy, processado para histologia clássica e analisado por microscopia de luz. Durante o período de transplante, foram realizadas análises ultrassonográficas para acompanhar o desenvolvimento do tecido ovariano. Na Etapa 1, a criopreservação com DMSO a 1,5 M mostrou-se mais eficaz. Durante as avaliações ultrassonográficas, foi possível identificar a presença de círculos hipoecóicos com diâmetro aproximado de 1 mm, nos animais 3,4 e 5. Tais estruturas correspondiam a folículos antrais. Nas biopsias , foi possível identificar folículos em todos os estágios do desenvolvimento. As porcentagens médias (±DP) de folículos morfologicamente normais encontrados nos fragmentos referentes às biopsias , realizadas nos dias 7, 14, 28, 49 e 63 pós-transplante, foram, respectivamente, 44,36±30,56, 46,95±13,97, 51,41±14,38, 54,80±36,47 e 37,70±31,11. A maioria dos folículos primordiais foi classificada como normal. Nas biopsias dos dias 7 e 14, houve grande concentração de folículos com o citoplasma do ovócito muito acidófilo e com ausência de núcleo (degeneração tipo 1). A partir do dia 14, muitos apresentaram-se com células da granulosa justapostas, que cobriam o local do ovócito, que estava ausente nestas estruturas (degeneração tipo 2). Em conclusão, é possível manter a morfologia folicular após criopreservação de tecido ovariano felino com DMSO a 1,5 M. Também é mantida a viabilidade e funcionalidade de tecido ovariano felino fresco após autotransplante. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT

In Brazil, all wild felids species are endangered. This way, assisted reproduction techniques are a valuable resource to keep these species against extinction. The domestic cat (Felis catus) has been an excellent experimental model for studying new techniques to apply to wild felids. The aim of this work was to test different protocols of cryopreservation and the capacity of ovarian autotransplantation to keep the viability and resume preantral follicle development in domestic cats. The cryopreservation test was performed to compare ethylene glycol (EG), dimethyl sulfoxide (DMSO) and the association of both (EG+DMSO) in the preservation of preantral follicles included st nd in ovarian tissue (1 stage). In the 2 stage of the experiment, five cats were submitted to bilateral ovarian hysterectomy. In these animals, six fragments of fresh ovary were immediately transplanted to the subcutaneous tissue of the dorsal neck Five biopsies were performed after 7, 14, 28, 49 and 63 days of transplantation. The ovarian tissue was fixed in Carnoy, processed for classical histology and analysed under light microscopy. During the transplantation period, the ovarian tissue development and localization was monitored by ultrassonographic analysis. In the Stage 1 of the experiment, the cryopreservation with DMSO 1,5 M showed to be more efficient. During the ultrassonographic evaluation it was possible to identify the presence of hypoechoic circles with approximately 2 mm of diameter in the transplanted tissue of animals 3, 4 and 5. These structures corresponded to antral follicles. In the biopsies it was possible to identify follicles in all developmental stages. The mean (±SD) percentages of morphologically normal follicles found in the biopsies at days 7, 14, 28, 49 and 63 post-transplantation were respectively 44.36±30.56, 46.95±13.97, 51.41±14.38, 54.80±36.47 e 37.70±31.11. The majority of the primordial follicles were classified as normal. At days 7 and 14 biopsies there was a great number of follicles with acidophilic cytoplasm and with absent of nucleus (Type 1 degeneration). From day 14 on, a lot of follicles showed juxtaposed granulosa cells covering the place where the oocyte should be (Type 2 degeneration). Both these follicles were classified as degenerated. In conclusion, it is possible to keep the morphology of ovarian follicles after cryopreservation with DMSO 1,5 M. It is possible to keep the viability and function of fresh feline ovarian tissue after autotransplantation.