Desenvolvimento de método para determinação de xenobióticos em imaturos de insetos necrófagos por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (LC-MS/MS)

Abstract

A entomotoxicologia forense advém da união da toxicologia e das ciências forenses com a entomologia, área da biologia que estuda os insetos. Em casos avançados de putrefação do cadáver, amostras de tecidos humanos para análise toxicológica não estão disponíveis, e a utilização de larvas de insetos para acessar a exposição a substâncias tóxicas pode auxiliar na elucidação da causa mortis. Os objetivos deste trabalho foram desenvolver e validar um método analítico para determinação de onze substâncias em larvas de insetos necrófagos e analisar amostras entomológicas coletadas pelo Instituto Médico Legal do Distrito Federal. O método desenvolvido envolveu extração sólido-líquido com purificação à baixa temperatura (ESL-PBT) e análise por LC-MS/MS. Após otimização por testes univariados e um planejamento fatorial, o método foi validado seguindo protocolos internacionalmente aceitos. Foi observado efeito significativo da matriz na resposta de todos os analitos, havendo a necessidade do uso de curva de calibração em matriz fortificada pré-extração e regressão por mínimos quadrados ponderados. Os limites de quantificação (LOQ) variaram entre 1,0 e 40 ng g-1 e o coeficiente de variação nos ensaios de repetitividade, entre 2,83 e 16,9%. O método validado foi utilizado para análise de 27 amostras de larvas coletadas de cadáveres do IML-DF entre 2009 e 2012. Em 37% das amostras foi determinada pelo menos uma substância: cocaína (3 amostras), seu metabólito benzoilecgonina (4 amostras), diazepam (3 amostras), carbamazepina (1 amostra) e amitriptilina (1 amostra). Os resultados encontrados neste estudo representam as primeiras amostras entomotoxicológicas analisadas no Brasil. O método desenvolvido para este trabalho pode suprir a demanda da Polícia Civil do Distrito Federal de uma ferramenta complementar para elucidar casos de morte relacionados a intoxicações em situações onde as matrizes toxicológicas usuais não se encontram disponíveis. ______________________________________________________________________________________ ABSTRACT

Entomotoxicology emerges as the union of toxicology, forensic sciences and entomology, the area of biological sciences that studies the insects. When the body is in advanced putrefaction state, human tissues for toxicological analysis may not be availabe, and the use of insect larvae to access exposure to toxic substances may aid in the elucidation of the causa mortis. The aims of this study were to develop and validate an analytical method for the determination of eleven substances in necrophagous insect larvae, and to analyze entomological samples collected by the Medico-Legal Institute of the Federal District (IML-DF). The method involves a solid-liquid extraction with low temperature purification (SLE-LTP) and analysis by LC-MS/MS. Upon optimization by univariate analysis and a factorial design, the method was validated following internationally accepted protocols. Significant matrix effect was observed for all analytes, indicating the need to use calibration curves in pre-extraction spiked matrix and regression using weighted least squares. The limits of quantification (LOQ) ranged from 1,0 to 40 ng g-1, with coefficient of variation determined in the repeatability assays between 2.83 and 16.9%. The validated method was used to analyze 27 larvae samples collected from corpses by the IML-DF between 2009 and 2012. At least one substance was determined in 37% of the samples analyzed: cocaine (3 samples), its metabolite benzoylecgonine (4 samples), diazepam (3 samples), carbamazepine (1 sample) and amitriptyline (1 sample). The results obtained in this study represent the first entomotoxicological samples analyzed in Brazil. The method developed can be implemented in the Civil Police of the Federal District as a complementary tool to elucidate intoxication-related deaths where usual toxicological matrices are not available.