Caracterização de unigenes na interação Musa acuminata-Mycosphaerella musicola : desenvolvimento de marcadores microssatélites e análise de expressão gênica

Abstract

Musa acuminata (AA), espécie selvagem, cujo cruzamento com Musa balbisiana (BB) deu origem as bananas comestíveis atuais, é uma potencial doadora de genes de resistência a estresses bióticos, como a Sigatoka amarela causada pelo fungo Mycosphaerella musicola. O objetivo deste estudo foi identificar locos microssatélites (SSR) identificados em genes envolvidos com resposta de defesa a doenças em bananeira, caracterizar os SSRs quanto ao polimorfismo e analisar os genes quanto a expressão diferencial durante a interação com o patógeno M. musicola. Foram construídas quatro bibliotecas de cDNA a partir do RNA total de 36 amostras de folha de M. acuminata Calcutta 4 e M. acuminata subgrupo Cavendish Grande Naine inoculadas e não inoculadas com M. musicola. As bibliotecas foram submetidas a sequenciamento 454 e aproximadamente 36.000 unigenes para cada genótipo foram identificados e anotados por BLASTX e KOG. A partir desses dados foi realizada uma busca de SSRs gênicos e foram desenhados pares de primers flanqueando os SSR utilizando o software Primer3 plus. Um total de 4.068 locos SSR foram identificados em Calcutta 4 e 4.095 em Cavendish Grande Naine. Destes, foram selecionados 95 locos SSR derivados de genes- candidatos envolvidos em resposta de defesa que foram caracterizados em 22 genótipos de M. acuminata contrastantes para a resistência as Sigatokas Negra e Amarela. Um total de 14 locos SSRs gênicos apresentaram polimorfismo (3 a 8 alelos/ loco) e PIC médio de 0,63 e foram utilizados para a análise fenética dos 22 genótipos de M. acuminata pelo método UPGMA. Os 14 locos SSR não foram suficientes para agrupar todos os genótipos quanto a resistência, no entanto houveram agrupamentos de genótipos resistentes com alta similaridade. A partir do subconjunto de 95 genes, foram desenhados 26 pares de primers específicos para a análise de expressão gênica diferencial por RT-qPCR. Os dados de expressão foram analisados no Miner e Rest para calcular a eficiência dos primers e expressão gênica diferencial. Vinte e dois pares de primers apresentaram especificidade e foram analisados por RT-qPCR em quatro pools de cDNA sintetizados com as amostras do bioensaio. Dos 22 genes analisados, sete foram selecionados para análise de cinetica de expressão diferencial em Calcutta 4 que é um genótipo resistente. Seis genes apresentaram regulação negativa. Os marcadores SSR gênicos identificados serão importantes ferramentas para uso em programas de melhoramento genético de bananeira e seleção assistida por marcadores. A análise da expressão de genes- candidatos envolvidos com defesa no patossistema Musa-Mycosphaerella é de grande importância para estudos futuros de transformação genética de bananeira visando a resistência a doenças em cultivares. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT

Musa acuminata (AA), a wild species, which, through crossing with Musa balbisiana (BB) is responsible for today´s edible bananas, is also a potential donor of resistance genes for biotic stresses such as Yellow Sigatoka caused by Mycosphaerella musicola. The objective of this study was to identify microsatellite loci (SSR) from unigenes related to defense and response to biotic stress, to characterize the SSRs for polymorphism and analyze the genes for differential expression during interaction with the pathogen M. musicola. Four cDNA libraries were constructed from total RNA from leaf samples of 36 M. acuminata Calcutta 4 and M. acuminata Cavendish Grande Naine plants, both non-inoculated and inoculated with M. musicola. The cDNA libraries were subjected to 454 sequencing and approximately 36.000 unigenes for each genotype were identified and annotated by BLASTX and KOG. From these data, a search of genic SSRs was performed and primer pairs were designed flanking the SSRs using the software Primer3 plus. A total of 4.068 SSR loci were identified in Calcutta 4 and 4.095 in Cavendish Grande Naine. Of these, 95 SSR loci were selected from candidate genes involved in defense responses and characterized in 22 M. acuminata genotypes contrasting in resistance to Black and Yellow Sigatokas. A total of 14 loci SSRs presented polymorphism (3-8 alleles / locus) and an average PIC value of 0.63. Employed in UPGMA phenetic analysis of the 22 M. acuminata genotypes, the 14 SSR loci were not sufficient to group all genotypes based upon disease resistance, although clusters with high similarity of resistant genotypes were observed. From the subset of 95 genes, 26 specific primer pairs were designed for analysis of differential gene expression by RT-qPCR. The expression data were analyzed with Rest and Miner to calculate primer efficiency and differential gene expression.Twenty-two primer pairs showed specificity and were analyzed by RT-qPCR in four pools of cDNA synthesized with the samples of the bioassay. Of the 22 genes analyzed, seven were selected for analysis of kinetics of differential expression in Calcutta 4 which is a resistant genotype. Six genes showed down regulation. The SSR gene markers identified will be important tools for use in banana breeding programs and marker assisted selection. Analysis of expression of resistance gene candidates in the pathosystem M. acuminata- M. musicola is of great importance for future studies on using genetic transformation for disease resistance development in cultivars.