Atividade in vitro e in vivo dos peptídeos Pa-MAP 1.5 E Pa-MAP 1.9 derivados de Pleuronectes americanus contra Klebsiella pneumoniae ATCC 13883

Abstract

Peptídeos antimicrobianos (PAM) são componentes do sistema imune inato da maioria dos seres vivos. Estas moléculas vêm despertando um crescente interesse como alternativas aos antibióticos clássicos, uma vez que podem apresentar atividade antimicrobiana potente contra um amplo espectro de microrganismos, inclusive contra microrganismos resistentes aos antimicrobianos disponíveis. Por mais dinâmica que sejam as indústrias farmacêuticas na busca por novos fármacos, é praticamente impossivel o mercado farmacêutico acompanhar o espantoso fenômeno da multirresistência apresentada por muitos microrganismos. Neste contexto, os PAMs surgem como uma alternativa farmacológica, pois podem ser usados isoladamente ou combinados entre si ou com outros antibióticos clássicos. Neste estudo foi avaliada a atividade antimicrobiana de dois peptídeos sintéticos e análogos denominados Pa-MAP 1.5 e Pa-MAP 1.9, derivados de um peptídeo do peixe Pleuronectes americanus. Os dois análogos tiveram sua homogeneidade e grau de pureza analisados por espectrometria de massa do tipo MALDI-TOF e posteriormente foram submetidos a ensaios antimicrobianos, isoladamente e em combinação, contra a bactéria Gram-negativa Klebsiella pneumoniae e avaliados também, com relação à sua atividade citotóxica Os resultados in vitro evidenciaram uma forte atividade sinérgica com CIM de 4/4g.ml-1, dos peptídeos, sendo que esta concentração não se mostrou citotóxica. Resultados dos testes In vivo, mostraram que a combinação de peptídeos foi eficiente, sendo observado um decréscimo notável de UFCs de K. pneumoniae no sangue bem como nos pulmões, de camundongos Black C57/bl6. Os animais foram tratados com os peptídeos combinados, inoculados por via intravenosa, utilizando concentrações de 36 mg.Kg-1, 18mg.Kg-1 e 9mg.Kg-1 para o peptídeo Pa-MAP 1.5; e para o peptídeo Pa-MAP 1.9 as doses utilizadas foram de 4mg.Kg-1, 2mg.Kg-1 e 1mg.Kg-1. Com o objetivo de entender como ocorre o acoplamento e a interação destes peptídeos, foram propostos modelos tridimensionais in silico através de modelagem molecular. Resultados das modelagens in silico sugerem uma estrutura em α-hélice anfipática, para ambos os peptídeos. Quando se realizou o acoplamento molecular dos peptídeos com uma membrana aniônica, os peptídeos conjugados 11 apresentaram uma alta taxa de afinidade, corroborando assim com os resultados experimentais in vitro e in vivo. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT

Antimicrobial peptides (AMPs) are innate immune system components, which are present in several living organisms. This molecules interesting is growing as an alternative for traditional antibiotics due to their potent antimicrobial activities against a broad range of microorganisms including those resistant to classical antibiotics. In spite of pharmaceutical companies dynamism for new drugs discovery, have been virtually impossible to pharmaceutical market to keep up the amazing multidrug resistance phenomen shown by many microorganisms. By this way, antimicrobial peptides stand out as promising pharmacological alternatives, since they can be used alone or in combination to classic antibiotic. In this view, the present study characterized the activity of two synthetic analogues, named Pa-MAP 1.5 and Pa-MAP 1.9 from Pleuronectes americanus fish. Both analogs had the homogeinity and purity degree checked by MALDI-ToF mass spectrometry. Moreover, peptides were assayed according their antibacterial activity, alone and in combination against Gram-negative Klebsiella pneumonia as well as their hemolytic activity. Data in vitro assay demonstrate a strong synergistic activity between peptides, with MIC of 4/4g.ml-1. Nevertheless at this concentration they did not showed cytolytic effects. The in vivo results showed that peptides combination were capable to pronounced decrease K. pneumoniae’s UFCs in blood count, as well in black C57/bl6 mouse’s lung. The animals were treated with the combined peptides via intravenously using concentrations of 36 mg.Kg-1, 18 mg.Kg-1 and 9 mg.Kg-1 for Pa-MAP 1.5; and 4mg.Kg-1, 2mg.Kg-1 e 1mg.Kg-1 for Pa-MAP 1.9. In order to understand these peptides interact in silico three-dimensional models were constructed by molecular modeling. Results of in silico modeling suggest amphipathic α-helical structures for both peptides. When molecular peptide docking was performed with anionic membranes, conjugated peptides showed high affinity rates, thus corroborating with in vitro and in vivo data presented.