Uso do glicerol, metil-formamida e dimetil-formamida como crioprotetores do sêmen canino

Abstract

A crescente demanda por biotécnicas reprodutivas em cães tem despertado grande interesse no desenvolvimento de protocolos de congelação de sêmen canino que, associados à correta identificação do momento ótimo para a inseminação, resultem em taxas de fertilidade próximas às da inseminação artificial com sêmen fresco ou resfriado. A grande vantagem da congelação do sêmen é a sua viabilidade por tempo indeterminado. O crioprotetor de eleição na congelação do sêmen canino é o glicerol, entretanto a busca por crioprotetores alternativos tem sido crescente. O presente trabalho objetivou comparar a eficiência da metil-formamida (MF) e da dimetil-formamida (DF) em relação ao glicerol (GL) como crioprotetores na congelação do sêmen canino. Para o experimento, foram utilizados pools de amostras de sêmen de cinco cães da Polícia Federal, coletadas por manipulação digital. Cada pool foi fracionado em três amostras, sendo cada uma delas submetida a um dos três crioprotetores, sempre à concentração final de 3% em diluidor Tris-gema. Cada tratamento foi repetido cinco vezes. O sêmen foi avaliado subjetivamente quanto à motilidade total e progressiva, vigor e morfologia logo após a coleta do sêmen, formação do pool, diluição, resfriamento e descongelação. As alíquotas foram resfriadas e equilibradas a 4°C por uma hora e meia e envasadas em palhetas de 0,5m?. Em seguida, procedeu-se a congelação, expondo-se as palhetas ao vapor de nitrogênio líquido por 15 minutos seguido de imersão e armazenamento no nitrogênio líquido. As palhetas foram acondicionadas em botijão criogênico por um período mínimo de sete dias antes da descongelação. A descongelação foi feita em banho-maria a 37°C durante um minuto, permanecendo a esta temperatura durante 30 minutos para a realização do teste hiposmótico (HOST). A longevidade espermática foi feita realizando-se o teste de termorresistência (TTR). A análise estatística foi realizada utilizando-se análises de variância (ANOVA) e teste PLSD de Fischer. As amostras de sêmen fresco apresentaram características físicas e morfológicas dentro da normalidade (93,60±7,60%, 90,40±8,70%, 4,8±0,44 e 90,25±3,17% para motilidade total, motilidade progressiva, vigor e morfologia normal, respectivamente). Após a descongelação, foram observadas diferenças significativas (P<0,05) entre GL e DF em relação à motilidade total e progressiva e vigor. Em relação à MF, não houve diferenças significativas em relação ao GL ou à DF em nenhum parâmetro avaliado. As médias para motilidade total, motilidade progressiva, vigor e morfologia normal na pós-descongelação foram 69,00±5,47%, 61,00±7,41%, 2,9±0,54% e 57,10±5,01% para o GL, 59,00±8,94%, 50,00±10,00%, 2,5±0,70 e 66,90±7,74% para a MF e 44,00±21,03%, 37,00±19,87%, 2,1±0,65 e 61,10±5,59% para a DF, respectivamente. No teste HOST o GL apresentou-se superior à MF e DF (57,80±12,47%, 35,80±18,47% e 34,40±9,40%, porcentagens médias de células com membranas íntegras para GL, MF e DF, respectivamente). Durante o TRT, não houve diferenças entre o GL e a MF e ambos mostraram-se superior à DF. De acordo com os resultados encontrados, pode-se concluir que a MF apresenta resultados semelhantes ao GL, e, portanto pode ser considerada uma alternativa como crioprotetor na criopreservação de sêmen canino. Testes comparando diferentes concentrações da MF são necessários visando seu melhor desempenho como crioprotetor. __________________________________________________________________________________________ ABSTRACT

Due to an increasing demand for canine reproductive biotechnologies, it has been crescent interests for improving freezing protocols employed for canine semen which, associated to a correct identification of optimal breeding time, results on fertility rates close to those achieved with artificial insemination with fresh or cooled semen. The unlimited viability of cryopreserved semen is the greatest advantage of this technique. Glycerol is the most commonly used cryoprotectant for dog sperm however the search for alternative cryoprotectants has increased. The aim of the present work was to compare the efficiency of methyl-formamide (MF), dimethyl-formamide (DF) and glycerol (GL) as cryoprotectants in canine semen cryopreservation. Five dogs were used in the experiment. Ejaculates were collected, pooled and divided into three aliquots and each one was submitted to one of the three cryoprotectants, with final concentration of 3% in egg yolk-TRIS extender. Treatments were repeated five times. Semen was subjectively evaluated for total and progressive motility, vigor and morphology immediately after each of the following procedures: semen collection, pool formation, dilution, chilling and freezing/thawing. Sperm membrane functional integrity was assessed by hypo-osmotic swelling test (HOST), ans longevity was assessed using the thermoresistance test (TRT). Fresh semen showed normal physical and morphological characteristics. After thawing, differences were observed between semen frozen using GL and DF regarding total and progressive motility and bigot (P<0.05) but not between MF and GL or MF and DF. Means for total motility, progressive motility, vigor and morphologically normal spermatozoa were respectively 69,00±5,47%, 61,00±7,41%, 2,9±0,54% e 57,10±5,01% for GL, 59,00±8,94%, 50,00±10,00%, 2,5±0,7 and 66,90±7,7% for MF and 4,00±21,03%, 37,00±19,87%, 2,1±0,65 and 61,10±5,59% for DF. On HOST, GL was superior to MF and DF (57,80±12,47%, 35,80±18,47% and 34,40±9,40%, respectively). During TRT, both GL and MF were superior to DF, with no differences between GL and MF. In conclusion, the use of MF as cryoprotectant showed results similar to GL, except on HOST, and can br considered as an alternative in canine semen cryopreservation. Further studies testing different concentrations of MF may improve its effects on cryopreservation of canine semen.