Efeitos das nanopartículas de maghemita estabilizadas com citrato em células de carcinoma submandibular humano in vitro

Abstract

Introdução: Diversos estudos discutem a segurança do uso de nanopartículas já que estas são capazes de promover alterações na expressão gênica, padrão epigenético, homeostase do ferro e estresse oxidativo em ensaios in vitro. Uma gama de estudos aponta diferentes comportamentos celulares em resposta à exposição a nanopartículas, mas ainda não existe um consenso sobre os reais benefícios e riscos que estes nanomateriais podem apresentar em um sistema biológico complexo. Portanto, torna-se necessário estudar estes riscos a fim de contribuir com o desenvolvimento de nanopartículas mais adequadas para aplicações biológicas. Objetivo: Avaliar e caracterizar os possíveis efeitos citotóxicos e epigenéticos em células de carcinoma de glândula submandibular humana (HSG) submetidas a exposição de nanopartículas de maghemita funcionalizadas com cobertura de citrato (NPs). Analisar possíveis alterações na expressão gênica mediante a quantificação do número de transcritos para determinados genes alvo comprometidos com a regulação epigenética e estresse oxidativo. Materiais e métodos: As NPM-citrato foram sintetizadas pelo método de coprecipitação de Fe (II) e Fe (III) e adição direta de ácido cítrico. Os ensaios de citotoxicidade foram realizados por detecção da lactato desidrogenase (LDH) e ensaio de MTT. A morfologia celular foi analisada por coloração panótica InstaProv em microscópio de luz. A detecção de ferro intracelular foi realizada pelo ensaio do Azul da Prússia. As quantificações de metilação global de DNA e de acetilação das histonas H3 e H4 foram realizados por ensaio colorimétrico. A expressão dos genes FERRH, FERRL, DNMT1, DNMT3a, HDAC1, HDAC2 e COX-2 foi realizada por qRT-PCR. Para análise da produção de espécies reativas de oxigênio foi utilizado protocolo de H2DCFA. Resultados: As NPM-citrato nas concentrações testadas de 0,5 mgFe/mL e 3,0 mgFe/mL não apresentaram efeito citotóxico pela metodologia empregadas. Contudo, foram observadas alterações na morfologia celular, como vacuolização citoplasmática nas células expostas a nanopartículas por 24h e 48h, presença de ferro intracelular mesmo após a retirada do tratamento, intensa produção de espécies reativas de oxigênio dose e tempo dependentes, diminuição no perfil global de metilação de DNA e acetilação das histonas H3 e H4: a acetilação da H3 diminui para 38% e 62% após os tratamentos com 0,5 mgFe/mL e 3,0 mgFe/mL, respectivamente. Para a H4 a hipoacetilação foi mais acentuada, diminuindo de 82% para 4% e 10% após os tratamentos com 0,5 mgFe/mL e 3,0 mgFe/mL, respectivamente. Diferenças entre o acúmulo de transcritos dos genes estudados também foram observadas: transcritos referentes aos genes de COX-2, FERRL, e FERRH encontraram-se aumentados, enquanto que DNMT3a sofreu uma diminuição no número de transcritos. Conclusão: Concluímos que as nanopartículas de maghemita recobertas com citrato são capazes de induzir vacuolização citoplasmática, acúmulo de ROS, diminuição do padrão de metilação global e de acetilação de H3 e H4, alteração do acúmulo dos transcritos COX-2, FERRH, FERRL, DNMT3a e HDAC1 sem comprometer a viabilidade das células HSG. Esse é o primeiro relato sobre os efeitos genéticos e epigenéticos das NPM-citrato sobre células HSG.