Divisão celular do Trypanosoma cruzi : o papel da subunidade TcSCC1 do complexo coesina e das proteínas centrinas

Abstract

Durante o processo de divisão celular os tripanossomatídeos e alguns microrganismos do reino Fungi mantém o núcleo intacto em um processo denominado de mitose fechada. Além disso, os tripanossomatídeos não apresentam condensação da cromatina e ocorre um alongamento do núcleo para acomodar os cromossomos já replicados. Em leveduras e metazoários, a manutenção das cromátides irmãs juntas durante a divisão celular até a sua separação na transição metáfase e anáfase é realizada pelo complexo coesina. Análise dos genomas de tripanossomatídeos mostrou que genes do complexo coesina e de proteínas centrinas estão presentes e são conservados. Para investigar a função da subunidade TcSCC1 do complexo coesina e das cinco proteínas centrinas preditas em T. cruzi, o agente etiológico da doença de Chagas, foram feitas clonagens dos genes TcSCC1 e TcCEN1 a 5. Para a análise de citolocalização dessas proteínas no parasita, os genes TcSCC1, TcCEN2, 4 e 5 foram subclonados no vetor de expressão transiente pRTEGFP que contém o promotor ribossomal, a região 5’UTR do gene para a amastina, o gene para a proteína fluorescente verde (EGFP) e a região 3’UTR do gene TCR27. A subclonagem foi realizada de modo que as proteínas de estudo foram expressas como fusão no N-terminal da EGFP. Esses plasmídeos foram utilizados em transfecção transiente e a expressão da EGFP com e sem as fusões proteicas foram visualizadas por microscopia de fluorescência. As centrinas 2, 4 e 5 e a subunidade TcSCC1 da coesina fusionadas com EGFP apresentaram uma localização predominantemente nuclear, embora não exclusivo, quando comparado com a EGFP sem fusão. Para verificar se as proteínas estudadas são expressas em T. cruzi foram realizadas análises de PCR quantitativa nas suas três formas de vida: amastigotas, epimastigotas e tripomastigotas. Verificamos que todos os genes são expressos na forma de mRNA. As centrinas 2 e 5 apresentaram a maior expressão relativa nas três formas enquanto que as centrinas 1 e 3 apresentaram expressão equivalente à GAPDH em amastigotas e epimastigotas, mas em tripomastigotas uma expressão maior. A centrina 4 apresentou uma expressão relativa muito menor que a GAPDH e às outras centrinas nas três formas do parasita. Deste modo, concluímos que as cinco centrinas e a subunidade SCC1 são expressas em T. cruzi com uma possível localização nuclear.