Otubaína de Leishmania infantum : atividade enzimática, super-expressão e caracterização funcional

Abstract

Enzimas deubiquitinantes (DUBs) desempenham um papel importante na regulação da degradação de proteínas e de outros processos não-degradativos, por desconjugação de ubiquitina (Ub) de proteínas marcadas, como a modulação da resposta imune, a sinalização da quebra da dupla fita do DNA e endocitose. Explorar o papel de deubiquitinação em Leishmania infantum demonstra uma alternativa promissora para procurar novos alvos terapêuticos para a leishmaniose, já que a quimioterapia utilizada é onerosa, tóxica e tende a ser ineficiente. Este estudo teve como objetivo o estabelecimento de duas linhagem de L. infantum expressando uma cópia extra de otubaína (OtuLi), caracterização da atividade enzimática e funcional da OtuLi recombinante produzida em E. coli (rOtuLi). Com relação ao estabelecimento das linhagens, o gene otuli foi amplificado, clonado no vetor pLEXSY-hyg2 e linearizado. Os promastigotas de L. infantum foram transfectados com os cassetes e selecionados. A integração dos cassetes ao locus gênico da 18S rRNA foi confirmada por PCR e a expressão da OtuLi fusionada ao peptídeo FLAG ou a cauda de 6 histidinas foi verificada por western blot. A citolocalização da FLAG-OtuLi indica que a enzima encontra-se em pequenas vesículas no citoplasma da célula com fortes marcações perto da região do cinetoplasto, corroborando o resultado visto utilizando anticorpos específicos para a OtuLi. A OtuLi não co-localiza com a mitocôndria marcada por duas sondas diferentes e com o retículo endoplasmático imunomarcado pela Proteína Dissulfato Isomerase em promastigotas. A rOtuLi apresentou atividade em pH ácido com substrato de tetra-ubiquitina ligado pela lisina 48 e o perfil de inibição indica que os inibidores NEM e Ub-aldeído são capazes de inibi-la. Através de mutações sítio-dirigidas realizadas na OtuLi, foi observado que tanto os resíduos próximos ao sítio catalítico quanto aqueles envolvidos na interação com a ubiquitina ocasionaram mudanças estruturais, conforme dinâmica molecular, resultando na redução ou perda da atividade da enzima. A rOtuLi foi capaz de estimular a formação de corpúsculos lipídicos em macrófagos peritoniais e induzir a secreção de IL-6 e TNF-α, citocinas pró-inflamatórias. O estabelecimento das linhagens com a cópia extra de otuli representa o primeiro passo para futura identificação de proteínas capazes de interagir com a OtuLi e assim, elucidar seu mecanismo de ação no parasito.