Análise da expressão de enterolobina em sementes e calos vegetais de Enterolobium contortisiliquum

Abstract

Toxinas citolíticas são produzidas por uma grande variedade de organismos, particularmente bactérias, alguns insetos, répteis e alguns vertebrados marinhos. Muitas dessas toxinas formam poros nas membranas das células, aumentando a sua permeabilidade e levando à morte celular. Entretanto, poucos exemplos têm sido estudados em plantas. Enterolobina foi a primeira proteína citolítica vegetal descrita na literatura. É uma proteína formadora de poros em membranas extraída de sementes de Enterolobium contortisiliquum. Este trabalho tem como objetivo verificar se calos de E.contortisiliquum são uma possível fonte para purificação da enterolobina, e comparar a expressão de proteínas em calos e sementes de E. contortisiliquum. Para produção de calos, sementes foram aleatoriamente selecionadas e escarificadas com lixa d’água em uma das faces e embebidas em água destilada overnight. Procedeu-se à desinfecção das sementes utilizando solução de hipoclorito de sódio a 30% e água destilada estéril. Inoculou-se uma semente para cada tubo de ensaio, contendo 20 mL de meio MS-61. Aguardou-se a germinação e desenvolvimento das plantas para seguir com os experimentos (aproximadamente 20 dias). Após esse período, foram realizados experimentos utilizando-se explantes de cotilédones, parte final dos cotilédones, hipocótilo e epicótilo, submetidos a 6 tipos de tratamentos em meio básico MS-61. Todas as culturas foram mantidas na luz (fotoperíodo: 16 horas luz/8horas escuro) a 27 ± ºC. Nos tratamentos com 2,4-diclorofenoxiacético (1mg/mL) e com ácido 2,4- diclorofenoxiacético (1mg/mL) e ácido abscísico (0.2 mg/mL) observou-se a formação de duas linhagens (verde e amarela, respectivamente) as quais foram utilizadas na preparação dos extratos de proteínas. Calos e sementes foram macerados em N2 líquido e pó de vidro e precipitadas com solução de TCA/acetona seguida pela extração e solubilização em tampão 2-DE. A concentração de proteína foi determinada utilizando-se Plus One 2D QuantKit (GE Healthcare). As amostras foram submetidas à focalização isoelétrica utilizando-se géis de gradiente imobilizados de pH (IPG) na faixa de 3-10. Para confirmar a presença de enterolobina, foi realizado immnublotting utilizando anticorpos de enterolobina produzidos em coelho. A análise comparativa dos mapas de 2-DE mostrou expressões diferenciadas entre sementes e calos. SDS-PAGE seguido de immnunoblotting não indicou a presença de enterolobina nos extratos de calos. Em sementes, cinco isoformas de enterolobina foram encontradas com pI aproximado na faixa entre 5 e 6. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT

Cytolytic toxins are produced by a variety of living organisms, particularly bacteria, certain insects, poisonous reptiles and stinging marine invertebrates. Many of these toxins appear to function simply by forming pores in cell membranes, disrupting the permeability barrier and leading eventually to cell death. However, few examples have been studied in plants. Enterolobin was the first plant cytolytic protein described in the literature. It is a membrane pore-forming protein extracted from Enterolobium contortisiliquum seeds. The current work aimed at assaying E. contortisiliquum callus as possible source material for enterolobin purification, and comparing protein expression in callus and seeds of E. contortisiliquum. For callus production, seeds were randomly selected and scarified, and then overnight incubated in distilled water. A solution of 30 % sodium hipochloride was used for seed decontamination. Each seed was placed into a tube containing 20 mL of MS-61 medium. Seed germination and development was allowed for twenty days. After this period, explants of cotyledons and hypocotyles were subjected to six different treatments containing MS-61 basic medium. The cultures were incubated at 27ºC (16h light / 8h dark). Media with 2-4-diclorofenoxiacetic acid (1mg/mL) and with 2-4-diclorofenoxiacetic acid (1mg/mL) plus abscisic acid (0.2 mg/mL) provided two callus lines (yellow and green, respectively) which were used for preparation of protein extracts. Callus and seeds were ground in liquid N and glass 2 powder, and the proteins precipitated with TCA/acetone solution followed by extraction and solubilization in 2-DE buffer. Protein concentrations were measured by using Plus One 2D QuantKit. The samples were submitted to 2-DE using immobilized pH gradient gels in the 3-10 pH range during isoelectric focusing. To confirm the presence of the cytolisin in callus and seeds 2-DE gels, immunoblotting was made using enterolobin antibodies raised in rabbit. Comparative analysis of 2-DE maps showed different expression between seeds and callus. SDS-PAGE followed by immunoblotting did not indicate the presence of enterolobin in callus extracts. In seeds, enterolobin five isoforms were found within the 5 to 6 pI zone.