Caracterização bioquímica e estudo funcional in vitro da dipeptidil peptidase 8 de Trypanosoma cruzi

Abstract

A doença de Chagas é endêmica da América Latina, tem como agente etiológico o parasito Trypanosoma cruzi. O tratamento da doença durante a fase crônica gera diversos efeitos colaterais. Nesse sentido, as proteases de tripanossomatídeos têm sido investigadas na busca de novos alvos terapêuticos. A dipeptidil peptidase 8 de Trypanosoma cruzi (DPP8Tc) é uma enzima que faz parte das prolyloligopeptidases, essa família possui membros com conhecida relevância médica, dentre elas está a enzima ortóloga DPPIV humana, cuja inibição é utilizada como uma das formas de tratamento da diabetes tipo II. A DPP8Tc, foi investigada neste trabalho por meio da caracterização bioquímica e por nocaute físico dos alelos do gene dpp8tc do parasito T. cruzi da cepa CL Brener. Os resultados obtidos indicam que a DPP8Tc é uma enzima dimérica, solúvel, ativa em tampão tris 50mM em pH situado entre 7,5 e 8,0 e melhora sua atividade com aditivos. A temperatura ótima para atividade enzimática situa-se em torno dos 28ºC e substrato específico, Gly-Pro-AMC. Com o uso deste substrato, foram obtidos os parâmetros KM de 10,78 μM, Kcat de 1,67x10-3 s-1, Vmax 4,6x10-5 μmol de AMC liberado/min e Kcat/KM:1,55x10μM-1s-1. Os inibidores clássicos de proteases exercem baixa inibição enzimática da DPP8Tc. Em contrapartida, os inibidores de DPPIV exercem maior taxa de inibição entre eles o IB-7, o mais potente, inibe em 96,59% da DPP8Tc, com constante de inibição (Ki) de 8,2 nM. Outros inibidores da DPPIV apresentaram os seguintes ICs-50: KS (IV) com 95,47 nM, IB-4 com 484,9 nM e por último, KAII-23 com 2,7μM. A inibição enzimática ocorre principalmente por inibidores que possuem o grupo adamantil na sua composição química, semelhante à composição do inibidor vidaglipitina da DPPIV humana. A atividade ótima ocorre em torno dos 28ºC, temperatura requerida à sobrevivência da forma epimastigota, indicando potencial função no barbeiro. O nocaute simples do gene dpp8tc, diminuiu em 50% a atividade enzimática, em 20% a fluorescência e aumentou 2,9% a taxa de infecção do parasito DPP8Tc+. As diferenças existentes nas regiões UTRs 5’ e 3’ dos alelos do gene DPP8Tc, impediu o sucesso do nocaute duplo, sendo necessária a construção específica de um cassete direcionado para o nocaute do segundo alelo, visando conhecer por completo a função da DPP8Tc de Trypanosoma cruzi.