Desenho, caracterização e encriptação de peptídeos bioativos como estratégia para o processo de entrega e otimização do perfil de atividade

Abstract

A caracterização de peptídeos encriptados em proteínas pode ser uma estratégia que possibilita diversas aplicações na biotecnologia, que vão desde o desenvolvimento de novos fármacos até a produção de plantas geneticamente modificadas. O presente estudo tem como objetivo geral a prospecção, bem como, o desenho de novas moléculas a partir de peptídeos encriptados em proteínas que possam apresentar atividades biológicas. Dessa forma, foram desenhados dois peptídeos que apresentam dupla atividade (opioide e hipotensora). Tais peptídeos foram sintetizados isoladamente e também de maneira que formassem uma única cadeia polipeptídica, dando origem a uma pequena proteínas de 35 resíduos contendo duas pontes dissulfeto denominada MTOXI. O objetivo do desenho da MTOXI é a otimização da atividade frente à ação de proteases, permitindo uma liberação possivelmente controlada de peptídeos. Tanto os peptídeos separadamente, quanto a proteína MTOXI foram sintetizados por meio de síntese química em fase sólida, seguida da purificação em cromatografia líquida em alta eficiência. O grau de pureza e a confirmação foram determinados por espectrometria de massa, MALDI e ESI. Os peptídeos foram testados em camundongos por via intraperitoneal, com intuito de avaliar sua possível atividade antinociceptiva nos testes da placa quente (Hot Plate) e teste de retirada da cauda (Tail Flick). Os testes in vivo demonstraram que os peptídeos sintéticos PSLEM 11011 e 11012 apresentaram atividade antinociceptiva com perfil de atividade mais lento e duradouro em relação à morfina. A proteína MTOXI foi digerida com tripsina, em quadruplicatas, sendo avaliado o perfil de proteólise e liberação dos fragmentos peptídicos durante uma hora. O ensaio da digestão foi analisado por LC-MS incluindo os controles positivo (digestão da proteína reduzida) e negativo. A área de cada fragmento no respectivo tempo foi determinada. Os peptídeos bioativos permaneceram íntegros durante o processo de digestão e apresentaram aumento na área ao longo do tempo, o que sugere que a estratégia desenvolvida é promissora para a liberação controlada de peptídeos e para otimização do perfil de atividade. Posteriormente foi iniciada a expressão de peptídeos antimicrobianos encriptados no genoma de Arabidopsis thaliana (planta modelo) para serem reinseridos no genoma da própria planta com o objetivo de diminuir a suscetibilidade da planta contra o fungo Botrytis cinerea. A utilização de peptídeos encriptados para desenhar peptídeos e proteínas com atividade biológica mostrou-se promissora para futuras aplicações biotecnológicas.