Quantificação do kDNA de Leishmania Viannia por qPCR em diferentes profundidades de lesões cutâneas de Leishmaniose Tegumentar Americana

Abstract

A Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) é um grande problema de saúde pública, e no Brasil ocorreu por todo o território nacional. Na época atual, ainda representa um grande desafio para o clínico, pela complexidade das formas de manifestação da doença. Os exames parasitológicos (esfregaço e cultura) e histopatológico apresentam uma boa especificidade diagnóstica, mas uma sensibilidade insatisfatória, em relação ao exame de imunofluorescência indireta (IFI) é caracterizado pela alta sensibilidade, mas uma baixa especificidade diagnóstica. A toxicidade dos tratamentos disponíveis fundamenta a busca frequente por técnicas mais precisas e menos invasivas no reconhecimento da LTA. Nesse estudo, utilizou-se a Reação em Cadeia da Polimerase em tempo real (qPCR) para quantificar o cinetoplasto do DNA (kDNA) de Leishmania spp. em lesões de LTA nas diferentes camadas da pele. O estudo recrutou pacientes com suspeita clínica de LTA, no Hospital Universitário de Brasília – HUB. Exames de IFI, esfregaço, cultura do aspirado da lesão, histopatológico e Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) convencional foram utilizados para alocar os pacientes em dois grupos: LTA e controle. A separação da epiderme da derme superior foi feita pela técnica de salt split skin, e as demais camadas foram separadas por bisturi estéril. A qPCR foi realizada de forma qualitativa e quantitativa utilizando os primers PPf-5’- GGC CCA CTA TAT TAC ACC AAC CCC-3’ e PPr-5’-GGG GTA GGG GCG TTC TGC GAA-3’, resultando em um amplificado de 120pb, para encontrar e quantificar o kDNA de Leishmania spp.. Foram incluídos 59 pacientes na pesquisa, sendo que 40 foram designados para o grupo LTA e 19 para o grupo controle. Dentre todos os exames utilizados para a alocação dos grupos, o histopatológico em relação à compatibilidade apresentou a maior acurácia diagnóstica (82,35% IC 95% = 69,75 - 90,43). A epiderme (159,1 x 106) e a derme superior (75,4 x 106) respectivamente, mostraram um maior número de parasitos do que na derme inferior (54,6 x 106) e hipoderme (16,8 x 106), porém, essa diferença não foi significantiva (p > 0.05). A acurácia obtida na derme superior (77,9% IC 95% = 65,9 - 86,7), foi significativamente maior que a acurácia das amostras da epiderme e hipoderme (p = 0,039 em ambas as comparações). No grupo LTA, a maior sensibilidade alcançada foi nas amostras da derme superior (67,5% IC 95% = 50,9 - 81,43), e no grupo controle, a epiderme, derme superior e hipoderme alcançaram 100% (IC 95% 82,3 - 100 / 82,5 - 100 / 81,5 - 100) de especificidade. Futuros estudos sobre a eliminação transepidérmica como mecanismo de defesa do parasito, devem levar em consideração o kDNA de Leishmania spp. encontrado na epiderme no presente estudo. Concluiu-se que técnicas de coletas mais superficiais e menos invasivas são suficientes para encontrar um grande número de parasitos de Leishmania spp..