Avaliação da ablação de CD90 em células primárias de glioblastomas humanos in vitro

Abstract

Os gliomas representam os tumores do sistema nervoso central (SNC) mais comuns e com alta taxa de incidência. Entre eles, o glioblastoma multiforme (GBM) é extremamente agressivo e com grande heterogeneidade intratumoral, sendo classificado como grau IV de acordo com a OMS. O paciente é submetido ao tratamento oncoquimioterápico, a Temozolomida, associado à radioterapia. Pouco se avançou em relação a evolução dos fármacos utilizados para o tratamento de GBM e os testes clínicos atuais revelam pouca melhora nas taxas de sobrevida, a qual é em média de 18 meses. Com a alta taxa de recidiva alinhada à falta de novos tratamentos, a busca por biomarcadores e a investigação biológica do GBM avançam de maneira promissora. Acredita-se que a resistência tumoral se deve à presença de células-tronco tumorais (CTC). Elas apresentam aspectos similares aos das células-tronco neuronais saudáveis, assim como a presença de certos marcadores moleculares indicadores um estado não diferenciado. A glicoproteína CD90 tem função de adesão celular no SNC e está presente em diversas células desse sistema. Porém, há estudos indicando uma superexpressão dessa proteína em CTCs de GBM, o que leva à investigação desse possível biomarcador em células primárias de GBM. A possibilidade de se utilizar de células de linhagens para o estabelecimento de metodologias e investigação de comportamentos in vitro, levou à análise da expressão de CD90 em U87MG, linhagem recorrente em estudos de GBM. Após a transdução com luciferase para futuros experimentos in vivo e ablação de CD90 para devida comparação com o controle e análise por citometria de fluxo, foi aferido que a linhagem U87MG é negativa para CD90, impossibilitando seu uso nos demais estudos. Dessa forma, amostras cirúrgicas humanas de GBM de dois pacientes foram processadas e, então, foi estabelecido o cultivo primário de GLIO1 e GLIO2. Após a ablação de CD90 nas duas amostras, obteve-se a confirmação, por citometria de fluxo, de que o grupo GLIO1 shCD90 e GLIO2 shCD90, teriam a expressão de CD90 reduzida em 42,78% e 68,6%, respectivamente. Assim, o ensaio de formação de oncoesferas foi realizado a fim de descobrir a influência de CD90 na formação de estruturas esferoides, as quais acredita-se serem compostas por CTCs. A ablação de CD90 influenciou na morfologia das oncoesferas, com menor densidade e com menor tamanho, e no número dessas estruturas entre 3 a 7 dias de cultivo, quando comparada com o grupo controle, tanto em GLIO1 quanto em GLIO2. Foi avaliada, também, a migração celular pelo teste in vitro de wound healing e CD90 demonstrou influência no tempo de fechamento da área do scratch, com o grupo GLIO2 shCD90 não tendo a mesma capacidade de migração celular quanto o grupo controle, GLIO2 WT. Ao mesmo tempo, realizou-se o teste de adesão por análise celular em tempo real (RTCA), o qual comprovou a influência da gliocoproteína na adesão e espalhamento das células em baixa (5x103), média (10x103) e alta (20x103) confluências. Portanto, esse trabalho permite inferir a influência do nível de expressão de CD90 em células primárias de GBM, sendo importante na migração, invasão e formação de nichos com CTCs, os quais irão propagar o tumor e conferir maior resistência oncoquimioterápica. Além disso, é evidenciada a importância de se realizarem mais estudos com o cultivo primário devido às diferenças biológicas encontradas nas duas amostras de tumor. A maior investigação de CD90 permitirá tanto a busca para tratamentos mais eficazes quanto para a predição do prognóstico mais assertivo quanto à característica tumoral.