Expressão de antígenos de multiepítopo de dengue e zika vírus em planta e baculovírus

Abstract

Dengue virus (DENV) e Zika virus (ZIKV) são arbovírus pertencentes à família Flaviviridae, gênero Flavivirus, que provocam milhões de infecções em todo o mundo. Devido à emergência do ZIKV em áreas endêmicas para o DENV, o diagnóstico clínico não consegue distinguir as viroses devido à similaridade dos sintomas. Além disso, os métodos sorológicos disponíveis no mercado têm baixa especificidade devido à alta similaridade entre as proteínas do DENV e do ZIKV que provocam reatividade cruzada entre os anticorpos anti-flavivírus. Assim sendo, o objetivo deste trabalho foi expressar antígenos de multiepítopo de DENV e ZIKV utilizando sistemas de planta e baculovírus recombinante para desenvolver kit diagnóstico sorológico específico para cada vírus. Os genes de multiepítopos foram desenhados através de alinhamento múltiplo e mapeamento de epítopos. Então, os genes foram clonados em um vetor viral vegetal, o Pepper mild mottle virus (PMMoV) e no vetor baseado em baculovírus para infecção em folhas de Nicotiana benthamiana e células TN5-B de Trichoplusia ni, respectivamente. Após as inoculações, plantas de N. benthamiana foram mantidas por 10 dias em condições favoráveis de crescimento, e as células TN5-B foram cultivadas por 72 horas a 28°C. Em seguida, os extratos de folha e de células TN5-B foram submetidos à análise eletroforética de proteínas e Western blotting. Os antígenos foram confirmados utilizando anticorpos anti-his e, então, foram purificados em gradiente de sacarose por ultracentrifugação para utilização nos ensaios de ELISA. Amostras de soro IgG positivas para DENV e ZIKV foram utilizadas em ELISA indireto. Os resultados mostram que os antígenos produzidos não apresentaram reatividade cruzada entre os soros dos pacientes e, portanto, são ótimos candidatos para o desenvolvimento de testes sorológicos mais específicos.