Caracterização morfofisiológica de espermatozoides do epidídimo e estabelecimento de protocolo para seu uso na produção in vitro de embriões bovinos

Abstract

A recuperação de espermatozoides da cauda do epidídimo (EP) permite o uso de gametas que seriam perdidos devido a morte ou falhas na capacidade reprodutiva de animais. Os EP diferem dos espermatozoides do ejaculado (EJ) por não serem expostos ao plasma seminal, essas diferenças fisiológicas podem interferir em fatores como a longevidade, vias de capacitação e potencial de fecundação. Portanto para que se possa estabelecer os procedimentos mais adequados para o uso eficiente de EP na produção in vitro de embriões (PIVE), melhor conhecimento sobre seu comportamento morfofisiológico é necessário. O presente estudo objetivou identificar o comportamento fisiológico de EP durante o processo de PIVE, estabelecer melhorias no protocolo de PIVE ao utilizar EP e, caracterizar morfologicamente os EP. EP e EJ foram coletados de sete touros Gir e utilizados em cinco experimentos. No Experimento 1 foi avaliado o efeito da suplementação com heparina (EP+) na longevidade e viabilidade espermática, e no experimento 2 a influência da heparina nas taxas de fecundação (TF). No experimento 3, dois gradientes descontínuos (Percoll e PureSperm) foram testados na PIVE, e sua influência no sexo dos embriões foi avaliada. O experimento 4 foi realizado para avaliar o tempo necessário que EP precisam para atingir o máximo de ovócitos fecundados, para isto, diferentes tempos de co-incubação (3, 6, 12 e 18h) foram propostos. Por fim, no experimento 5 foi realizada a caracterização morfológica de EP utilizando a microscopia de força atômica (MFA). Os dados obtidos nos experimentos 1 e 5 foram submetidos à análise de variância (ANOVA) seguido de comparação múltipla de Tukey-Kramer (P≤0,05), além disso uma análise dos componentes principais foi realizada no experimento 5. Os resultados da TF e produção embrionária foram analisados pelo Qui-quadrado (P≤0,05) e a sexagem embrionária pelo teste de Wilcoxon (P≤0,05). Os experimentos 1 e 2 mostraram que a heparina afetou a viabilidade, longevidade e o tempo necessário para EP fecundar os ovócitos. Após 6h, o grupo EP+ já havia fecundado 82% dos ovócitos, sendo superior aos grupos EJ (19%) e EP (42%). Às 12 e 18h, a TF permaneceu mais alta no grupo EP+, e um aumento gradual na polispermia foi observado. No Experimento 3, o uso de gradientes para a seleção espermática de EP apresentou maior produção embrionária (Percoll 54%; PureSperm 52%) do que o observado no método de lavagem (37%), após sete dias de cultivo embrionário. Os embriões produzidos por EP selecionados em gradiente resultaram e um desvio de sexo em favor de embriões machos. Em relação ao tempo necessário para co-incubação analisado no experimento 4, não foram observadas diferenças entre os grupos. Os dados obtidos na MFA, experimento 5, mostraram que as dimensões uni, bi e tri dimensionais não diferiram entre os grupos EP e EJ. Entretanto, os descritores de forma mostram que o grupo EP apresentou maior rugosidade e elongamento, e menor fator de forma e taxa de circularidade. Concluindo, ao utilizar EP o tempo de fecundação in vitro pode ser reduzido para 6h sem afetar a produção e qualidade do embrião, a seleção espermática do EP pode ser realizada utilizando Percoll ou PureSperm, no entanto, um desvio de sexo nos embriões produzido foi observado. Quanto às características morfológicas, EP e EJ coletados dos mesmos reprodutores são morfologicamente semelhantes em 19 dos 24 parâmetros avaliados, indicando que ausência de plasma seminal não afeta a morfologia de EP.